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短篇论著
349例骨髓增生异常综合征患者U2AF1基因突变的临床研究
中华血液学杂志, 2017,38(01): 68-70. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-2727.2017.01.015
摘要
引用本文: 吴凌云, 祁岳坤, 许峰, 等.  349例骨髓增生异常综合征患者U2AF1基因突变的临床研究 [J]. 中华血液学杂志,2017,38( 1 ): 68-70. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-2727.2017.01.015
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骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes,MDS)是一组起源于骨髓造血干/祖细胞的恶性克隆性疾病,其典型特征为骨髓造血细胞发育和增殖异常,高风险向白血病转化[1]。目前,MDS发病机制尚未完全明了。高通量的全基因组和外显子测序发现MDS存在大量的基因突变,其中主要包括RNA剪切体、表观遗传学调控、细胞黏附分子及细胞信号通路相关分子等[2]。RNA剪切体相关基因突变可能是MDS疾病发病的起始事件,其中最为常见的剪切体相关基因突变为SF3B1突变,并与环状铁粒幼红细胞增多明显相关[3];而另一个在MDS患者中突变率较高的为U2小核RNA辅助因子1(U2AF1)基因[4,5,6],目前国内尚无大样本MDS患者U2AF1基因突变的研究报道。我们采用二代靶向测序对349例初发MDS患者进行了U2AF1突变检测,现就U2AF1突变MDS患者的临床和实验室特征报道如下。

病例与方法
1.病例资料:

回顾性分析2009年1月至2014年12月我科诊断的349例MDS患者资料,其中男195例,女154例,中位年龄56(16~89)岁,标本采集时患者均未接受化疗及去甲基化药物治疗。按照WHO 2008分类标准[7],难治性血细胞减少伴单系发育异常(RCUD)23例,难治性贫血伴有环状铁粒幼红细胞(RARS)10例,难治性血细胞减少伴有多系发育异常(RCMD)154例,难治性贫血伴原始细胞增多1型(RAEB-1)82例,RAEB-2 72例,MDS不能分类(MDS-U)7例,MDS伴有单纯5q-1例。按国际预后评分系统(IPSS)[8]进行预后分层,其中低危27例,中危-1 203例,中危-2 78例,高危34例,无法评估7例。染色体核型分析:正常核型206例;+8 36例,20q-18例,-7/7q-13例,-5/5q-9例,复杂核型26例,其他核型异常(除外上述核型异常者)39例;7例检测失败。

2.骨髓液采集和基因组DNA抽提:

于髂后或髂前上棘局部麻醉后抽吸骨髓液5 ml,Ficoll-hypaque淋巴细胞分离液(瑞典LymphoprepTM公司产品)分离单个核细胞,采用DNA抽提试剂盒(德国Qiagen公司产品)抽提基因组DNA。

3.二代靶向测序:

采用TruSeq DNA Sample Preparation试剂盒(加拿大Illumina公司产品)准备基因组DNA库,具体操作参照说明书。采用AB 2720 Thermal Cycler(美国Life Technologies Corporation公司产品)进行基因扩增,设计引物覆盖U2AF1所有编码序列(9个外显子),扩增条件如下:95 ℃ 2 min;94 ℃ 20 s,63 ℃ 40 s,共11个循环,72 ℃ 1 min。PCR产物进入下一步的测序分析(按照操作标准),采用MiSeq Benchtop测序仪(加拿大Illumina公司产品)进行测序,由上海天昊生物科技有限公司完成并协助数据分析。

4.地西他滨治疗方案:

地西他滨20 mg·m-2·d-1×5 d,每28 d为1个疗程,根据患者骨髓抑制情况适当调整疗程间隔时间。除治疗过程中出现疾病进展而停药外,患者接受至少4个疗程地西他滨治疗后进行疗效评估。

5.疗效评估标准及随访:

患者疗效评估根据修订的2006年MDS国际工作组(IWG)评价标准,包括完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、骨髓CR(mCR)、血液学改善(HI)。随访截止时间为2015年12月,中位随访24个月。主要随访指标包括总生存(OS)时间和白血病转化(转白)时间。OS是指从患者发病至因任何原因引起死亡的时间间隔。骨髓原始细胞≥20%定义为转白,转白时间指患者从发病到转化为白血病的时间间隔。

6.统计学处理:

所有数据采用SPSS 18.0软件进行统计学分析。两样本计量资料的比较采用t检验(符合正态分布、方差齐),两样本率的比较采用卡方检验或者确切概率法,Kaplan-Meier法用于生存分析,突变组与非突变组比较采用Log-rank检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结果
1.MDS患者U2AF1基因突变的发生频率:

在收集的349例MDS患者骨髓标本中,共检测出30例(8.6%)患者U2AF1突变,26例患者U2AF1突变位于2号外显子101位点的胞嘧啶碱基,其中13例胞嘧啶置换为胸腺嘧啶(c.101C>T),导致蛋白序列的第34位的丝氨酸被苯丙氨酸代替(p.S34F),另外13例U2AF1蛋白序列的第34位丝氨酸被酪氨酸代替(p.S34Y);3例患者检测到c.470A>G错义突变,导致蛋白序列第157位谷氨酰胺被脯氨酸代替(p.Q157P);1例患者检测出p.G215fs移码突变。U2AF1等位基因变异频率(VAF)为0.399(0.263~0.265),所有患者均为杂合突变。

2.U2AF1突变与未突变患者临床和实验室特征差异比较:

比较U2AF1突变和未突变患者的年龄、性别、WHO分型、染色体核型、骨髓原始细胞比例、IPSS分层等特征,结果见表1,U2AF1突变组男性比例明显高于未突变组(P=0.005)。U2AF1突变组+8和20q-染色体异常比例明显高于未突变组。30例U2AF1突变患者中9例(30%)为+8,而未突变组+8仅占9%(P=0.001)。13例p.S34Y突变患者7例为+8。30例U2AF1突变患者中6例(20%)为20q-,而未突变组20q-比例为4%(P=0.002)。两组患者的年龄、WHO分型和IPSS分层差异均无统计学意义。

表1

U2AF1突变组和未突变组骨髓增生异常综合征患者的临床和实验室特征比较

表1

U2AF1突变组和未突变组骨髓增生异常综合征患者的临床和实验室特征比较

临床特征U2AF1突变组(30例)U2AF1未突变组(319例)χ2值/tP
中位年龄[岁,M(范围)]55(22~78)56(16~89)0.1700.861
性别(男/女)24/6171/1487.7490.005
WHO分型(例数)  4.1200.501
 RCUD023  
 RARS010  
 RCMD13141  
 RAEB-1/217137  
 MDS不能分类07  
 MDS伴单纯5q-01  
染色体核型(例数)  29.016<0.001
 正常919711.4330.001
 +892713.7470.001
 20q-61214.7810.002
 -5/5q-09  
 -7/7q-013  
 复杂核型026  
 其他6332.5750.126
骨髓原始细胞比例(%, ±s )7.3±1.25.8±0.46.811<0.001
IPSS分层(例数)  1.2330.267
 低危17215  
 高危1298  

注:RCUD:难治性血细胞减少伴单系系发育异常;RARS:难治性贫血伴有环状铁粒幼红细胞;RCMD:难治性血细胞减少伴多系发育异常;RAEB:难治性贫血伴原始细胞增多;IPSS:国际预后积分系统

3.U2AF1突变患者的生存和转白情况:

生存分析显示U2AF1突变组患者中位生存时间[18(95% CI 12~24)个月]明显短于未突变组[54(95% CI 39~69)个月](P=0.016)。30例U2AF1突变患者中有12例(40%)转白,而未突变组73例(23%)转白,两组转白率差异有统计学意义(P=0.037),中位转白时间分别为20个月(未能计算95% CI)和未到达(P=0.030)。在36例+8染色体异常的患者中,U2AF1突变组和未突变组中位OS时间分别为16(95% CI 0~38)个月及54(95% CI 12~96)个月(P=0.013)。在18例20q-染色体异常的患者中,U2AF1突变组和非突变组中位OS时间分别为26个月(未能计算95% CI)及48(95% CI 20~76)个月,由于例数过低未进行统计比较。

4.U2AF1突变患者对地西他滨治疗的反应:

30例U2AF1突变患者中有16例接受地西他滨治疗,9例患者获得治疗反应,包括4例CR、3例mCR+HI、1例mCR、1例HI,总反应率为56%。U2AF1未突变组中有71例接受地西他滨治疗,44例获得治疗反应,包括23例(32%)CR、3例mCR+HI、9例mCR、9例HI,总反应率为62%。两组总反应率差异无统计学意义(P=0.672)。

讨论

2011年Yoshida等[4]首先在MDS患者报道U2AF1基因突变,此后有多个中心相继报道在MDS患者中检测到U2AF1基因突变,在初发MDS患者U2AF1突变率为8.7%~11.6%[5,9,10,11]。到目前为止,共发现10种不同类型的U2AF1突变,而几乎所有的突变均位于S34或Q157位点的锌指结构域。本研究我们对349例MDS患者进行二代靶向测序,结果发现30例患者U2AF1突变(突变率为8.6%),与国外报道基本一致。其中26例(87%)患者的突变位点位于S34,3例突变位于Q157,仅1例位于G215的移码突变。到目前为止,尚无G215位点同类型突变的研究报道,因此其临床意义有待于进一步证实。与国外其他中心研究一致的是本组患者所有U2AF1突变均为杂合突变。

通过对U2AF1突变患者的临床特征进行分析,我们发现U2AF1突变组20q-和+8比例更高。国外Graubert等[5]和Bacher等[12]也发现U2AF1突变高发于20q-患者,在20q-患者中U2AF1突变发生频率为20.0%~30.0%,而在其他核型为7%~9%。但关于U2AF1突变在+8患者中高发,国内外尚无相关的研究报道。对于U2AF1突变高发于20q-和+8患者的机制目前尚不明确,可能是染色体异常与U2AF1基因突变存在内在联系,也可能是一种巧合。而染色体核型异常与基因突变两者何者为先发事件也不清楚。分选携带U2AF1突变的20q-和+8患者不同阶段的造血干/祖细胞进行突变和染色体核型分析,可能有助于回答上述问题。动物研究显示单纯U2AF1突变本身并不引起MDS,而是作为该病病程中的早期事件[13]。因此我们推测,U2AF1基因突变导致mRNA剪切异常,引起与维持染色体核型稳定遗传相关的基因表达及功能异常,从而导致染色体的异常改变,可能是导致MDS发病的机制之一。与大多数国外研究[4,5,10]一致的是,我们的研究显示了U2AF1突变患者具有较高的转白率和较短的OS时间。但也有研究显示U2AF1突变并非疾病的预后因素[9,11],这可能与病例数及随访时间长短不同有关。我们进一步分析+8患者中U2AF1突变组和未突变组的生存情况,结果显示突变组中位OS时间明显短于非突变组。分析U2AF1突变和未突变患者接受地西他滨治疗的疗效,总反应率差异无统计学意义,这与Hong等[14]的研究结果一致。尚不能认为U2AF1突变对地西他滨疗效有预示作用。但由于本研究中U2AF1突变组接受地西他滨治疗的例数较少,因此仍待大样本研究进一步证实。

U2AF1突变如何导致细胞生物学功能改变,进而导致细胞增殖异常的机制目前尚不明确。研究显示突变并非导致蛋白功能的丧失,而是引起其功能的改变。U2AF1 S34F/Y的突变后促进其对AG前含有C或者A的3' SS优先识别;并抑制对含T的3' SS识别[15]。然而U2AF1突变如何导致其对mRNA结合位点的不同选择结合机制尚不明确,而U2AF1突变后其与其他剪切体相关分子结合的改变及如何进一步导致疾病仍有待于深入的研究。有研究提示U2AF1突变可能通过对表观遗传调控分子如BCOR、ASXL1和DNTM3A等的异常剪切从而致病[16]。临床上,MDS患者ASXL1基因是最常见的与U2AF1基因发生共突变的基因[6],似乎支持这种推测。U2AF1突变后通过下调抑癌微小RNA也可能是导致MDS发病的机制之一[17]

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