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论著
O-GlcNAc糖基化对Nalm-6细胞生物学行为及依托泊苷诱导凋亡的影响
中华血液学杂志, 2017,38(03): 237-242. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-2727.2017.03.012
摘要
目的

研究O连接的N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)糖基化及乙酰氨基葡萄糖转移酶(OGT)对Nalm-6细胞生物学行为及对依托泊苷(Vp16)诱导凋亡的影响。

方法

利用OGT抑制剂Alloxan构建低O-GlcNAc修饰的Nalm-6细胞模型,CCK-8法检测Alloxan对细胞增殖的影响,流式细胞术检测Alloxan对细胞凋亡及细胞周期的影响;以不同浓度的Vp16处理Nalm-6细胞12 h,Western blot检测O-GlcNAc糖基化修饰程度及OGT表达量的变化;以Alloxan处理Nalm-6细胞24 h后再加入Vp16(5 μg/ml)处理12 h,应用流式细胞术检测不同组别细胞凋亡,Western blot检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达情况。

结果

随着Vp16浓度的增加,Nalm-6细胞O-GlcNAc修饰及OGT表达均逐渐上调(P<0.05);Alloxan可抑制Nalm-6细胞增殖,诱发Nalm-6细胞凋亡[(15.190±2.539)%对(21.910±4.105)%,P=0.007],阻滞细胞周期[G1期:(43.534±4.453)%对(57.322±6.091)%,P=0.003;S期:(50.747±5.937)%对(37.201±4.661)%,P=0.001];Alloxan可抑制Vp16诱导的Nalm-6细胞凋亡[(75.195±13.845)%对(52.741±10.815)%,P=0.011],并伴随Bax表达下调(5.496±1.998对2.950±0.703,P=0.015)、Bcl-2表达上调(0.454±0.125对0.803±0.223,P=0.013)。

结论

通过抑制OGT而改变Nalm-6细胞O-GlcNAc修饰程度可影响其增殖、凋亡、改变细胞周期并抑制Vp16诱导的细胞凋亡。

引用本文: 张冰, 李栋, 时庆, 等.  O-GlcNAc糖基化对Nalm-6细胞生物学行为及依托泊苷诱导凋亡的影响 [J]. 中华血液学杂志,2017,38( 3 ): 237-242. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-2727.2017.03.012
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O连接的N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)糖基化是由Zachara和Hart首次发现的一种重要的蛋白质翻译后修饰[1]。O-GlcNAc糖基化是一个动态可逆的过程,由乙酰氨基葡萄糖转移酶(OGT)负责糖基化,N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(OGA)负责去糖基化。在生物体内,O-GlcNAc糖基化控制基本的生命过程,例如蛋白质的合成、染色质的结构、DNA脱甲基化以及生物昼夜规律。AKT[2]等信号蛋白以及c-Myc[3]、p53[4]、NF-κB[5]等转录因子都存在O-GlcNAc糖基化修饰。近年来,大量研究证实O-GlcNAc糖基化蛋白在乳腺癌[6]、前列腺癌[7]、膀胱癌[8]等多种肿瘤中发挥重要作用,但并没有在急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)以及其耐药方面中进行相关研究。本研究选用B-ALL细胞株Nalm-6细胞作为主要研究对象,从糖生物学角度分析O-GlcNAc糖基化及相关酶OGT在B-ALL发展及对依托泊苷(Vp16)诱导凋亡方面的作用,并初步探讨其作用机制。

材料与方法
1.主要试剂和仪器:

胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司;RPMI 1640培养基购自美国Hyclone公司;CCK-8细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒购自日本同仁公司;四氧嘧啶(Alloxan)、Vp16为江苏恒瑞医药公司产品;鼠源β-actin、Bax、兔源Bcl-2一抗均购于美国Proteintech公司;鼠源O-GlcNAc糖基化特异性抗体RL2、兔源OGT一抗购自美国Abcam公司;山羊抗兔二抗购自北京中杉金桥生物公司;细胞周期和凋亡检测试剂盒、AnnexinⅤ-FITC/碘化丙锭(PI)细胞凋亡试剂盒购自美国BD公司;Guava easy-Cyte8H流式细胞仪购自美国EMD Millipore公司;C-Digit化学发光仪购自美国LI-COR公司。

2.细胞培养:

Nalm-6细胞株为山东大学齐鲁医院低温实验室保存,用含10%FBS的RPMI 1640培养基(含100 U/ml青霉素/链霉素),在37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养,2~3 d换液1次。取对数生长期细胞进行实验。

3. Western blot法检测OGT、O-GlcNAc糖基化及凋亡相关蛋白水平:

将Nalm-6细胞接种于6孔板中,分别加入终浓度为0、5和10 mmol/L的Alloxan,作用24 h后收集细胞,PBS缓冲液洗2遍以去除残留的培养基,每个样品加入100 μl细胞裂解液提取总蛋白。BCA法测定蛋白浓度。取适量蛋白进行SDS-PAGE,转印至聚偏二氟乙烯膜(PVDF),室温于TBST缓冲液溶解的50 g/L脱脂奶粉中封闭1 h,用TBST缓冲液洗膜3次,加入RL2、OGT一抗后室温摇床孵育1 h,再置于4 ℃冰箱中孵育过夜,用TBST缓冲液洗膜3次,于相应的二抗室温孵育1 h,TBST缓冲液洗膜3次,将膜置于C-Digit化学发光仪曝光显影。同法检测不同浓度的Vp16处理后O-GlcNAc水平变化以及Alloxan联合Vp16作用后凋亡相关基因Bax、Bcl-2在蛋白水平的变化。

4. CCK-8法检测细胞增殖:

取对数生长期的Nalm-6细胞,分为Alloxan处理组和对照组,同时设置空白组(不加细胞)。将细胞种于96孔板中(每孔100 μl,细胞密度为5×105/ml),每组设置3个复孔。Alloxan处理组加入Alloxan(终浓度10 mmol/L),分别于加药培养后0、1、2、3、4 d加入CCK-8检测试剂(每孔10 μl),在37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养2 h,肉眼观察染色情况,然后用酶标仪检测450 nm处吸光度(A)值。结果以相对吸光度值表示。

5.流式细胞术检测细胞周期:

分为对照组和Alloxan处理组。将Nalm-6细胞接种于12孔板中(每孔1 ml,细胞密度为4×105/ml),Alloxan处理组加入Alloxan(终浓度5 mmol/L),对照组加入等量无菌水,置于培养箱中继续培养24 h,收集细胞,用预冷的PBS缓冲液洗2遍,加入75%乙醇固定过夜,第2天用预冷的PBS缓冲液洗涤细胞,每个样本加入500 μl PI染色液,避光孵育15 min,上机检测细胞周期。

6.流式细胞术检测细胞凋亡:

先向Nalm-6细胞中加入Alloxan(终浓度5 mmol/L),对照组加入等量无菌水,作用24 h后加入Vp16(终浓度5 μg/ml),12 h后收集各组细胞,倒置显微镜下进行细胞计数。每组取1×106个细胞,用PBS洗2遍,300×g离心5 min后弃上清,用100 μl 1×AnnexinⅤ结合液重悬细胞,加入PI和FITC标记的AnnexinⅤ各5 μl,室温避光孵育20 min,再加入1×AnnexinⅤ结合液100 μl,混匀后上机检测。

7.统计学处理:

应用SPSS 19.0进行数据分析,数据以±s表示。用单因素方差分析进行多组间数据比较,用t检验进行两组间数据比较。P<0.05为差异有统计学意义。

结果
1. Western blot检测Alloxan对Nalm-6细胞OGT表达及O-GlcNAc糖基化水平的影响:

以不同浓度的Alloxan处理细胞24 h后,Nalm-6细胞OGT表达以及O-GlcNAc糖基化程度逐渐降低(P<0.05),并且有一定的剂量依赖性。Alloxan浓度为10 mmol/L时,O-GlcNAc降低最为明显,可以此浓度构建低O-GlcNAc细胞模型。详见图1

图1
Western blot检测不同浓度四氧嘧啶(Alloxan)对Nalm-6细胞乙酰氨基葡萄糖转移酶(OGT)表达和O-GlcNAc糖基化的影响(P<0.05,n=6)
图1
Western blot检测不同浓度四氧嘧啶(Alloxan)对Nalm-6细胞乙酰氨基葡萄糖转移酶(OGT)表达和O-GlcNAc糖基化的影响(P<0.05,n=6)
2. Western blot检测Vp16对Nalm-6细胞OGT表达及O-GlcNAc糖基化水平的影响:

随着Vp16浓度的增加,Nalm-6细胞内OGT表达量逐渐增加。在低浓度Vp16组,细胞总蛋白O-GlcNAc糖基化程度变化不明显,当Vp16浓度达到1 μg/ml时,O-GlcNAc糖基化程度明显增高(P<0.05,n=6)。详见图2

图2
依托泊苷(Vp16)对Nalm-6细胞乙酰氨基葡萄糖转移酶(OGT)表达和O-GlcNAc糖基化水平的影响(P<0.05,n=6)
图2
依托泊苷(Vp16)对Nalm-6细胞乙酰氨基葡萄糖转移酶(OGT)表达和O-GlcNAc糖基化水平的影响(P<0.05,n=6)
3. CCK-8法检测Alloxan对Nalm-6细胞增殖、凋亡影响:

以10 mmol/L Alloxan作用于Nalm-6细胞后,连续4 d进行CCK-8法检测。结果表明,在Alloxan处理第1天时,细胞增殖已经受到明显抑制(P=0.022),随着药物作用时间延长,Alloxan仍能显著抑制细胞增殖(P<0.001)(表1)。以10 mmol/L Alloxan处理Nalm-6细胞24 h后,Alloxan组细胞的凋亡率为(21.910±4.105)%,而对照组(未处理)凋亡率仅为(15.190±2.539)%,差异有统计学意义(P=0.007)(图3)。

表1

CCK-8法检测四氧嘧啶(Alloxan)对Nalm-6细胞增殖的影响(相对吸光度值,±s

表1

CCK-8法检测四氧嘧啶(Alloxan)对Nalm-6细胞增殖的影响(相对吸光度值,±s

组别样本数1d2d3d4d
对照组61.421±0.1861.949±0.3222.602±0.2592.862±0.229
Alloxan组61.179±0.1141.236±0.1161.880±0.2332.023±0.297
t值 2.7175.1245.0625.479
P值 0.022<0.001<0.001<0.001
图3
流式细胞术检测四氧嘧啶(Alloxan)对Nalm-6细胞凋亡的影响
图3
流式细胞术检测四氧嘧啶(Alloxan)对Nalm-6细胞凋亡的影响
4.流式细胞术检测Alloxan对Nalm-6细胞周期的影响:

10 mmol/L Alloxan处理Nalm-6细胞48 h后,对照组G1期细胞比例为(43.534±4.453)%,S期细胞比例为(50.747 ±5.937)%;Alloxan处理组G1期Nalm-6细胞比例高于未用Alloxan处理的对照组(t=3.827,P=0.003),S期细胞比例高于对照组(t=4.396,P=0.001),G2期细胞比例两组差异无统计学意义(t=1.928,P=0.083),详见表2图4。上述结果表明,Alloxan可将Nalm-6细胞周期阻滞于G1期,减少进入S期的细胞比例。

表2

四氧嘧啶(Alloxan)对Nalm-6细胞周期的影响(%,±s

表2

四氧嘧啶(Alloxan)对Nalm-6细胞周期的影响(%,±s

组别样本数细胞周期
G1S期G2
对照组643.534±4.45350.747 ±5.9375.361±0.728
Alloxan组657.322±6.09137.201±4.6614.933±0.675
t值 3.8274.3961.928
P值 0.0030.0010.083
图4
流式细胞术检测四氧嘧啶(Alloxan)对Nalm-6细胞周期的影响

A:Alloxan组;B:对照组

图4
流式细胞术检测四氧嘧啶(Alloxan)对Nalm-6细胞周期的影响
4. Alloxan对Vp16诱导Nalm-6细胞凋亡的影响:

10 mmol/L Alloxan处理后的Nalm-6细胞经5 μg/ml Vp16作用12 h,流式细胞术检测显示细胞凋亡率低于未处理组[(52.741±10.815)%对(75.195±13.845)%,t=3.146,P=0.011](图5A),Western blot检测显示促凋亡蛋白Bax蛋白表达下调(5.496±1.998对2.950±0.703,t=2.944,P=0.015)、抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达上调(0.454±0.125对0.803±0.223,t=3.017,P=0.013)(图5B)。

图5
四氧嘧啶(Alloxan)对依托泊苷(Vp16)诱导Nalm-6细胞凋亡的影响

A:流式细胞术检测Alloxan作用前后Vp16所致Nalm-6细胞凋亡;B:Western blot检测Alloxan对Vp16诱导Nalm-6细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

图5
四氧嘧啶(Alloxan)对依托泊苷(Vp16)诱导Nalm-6细胞凋亡的影响
讨论

细胞内能量代谢异常被认为是肿瘤细胞的典型特征[9]。O-GlcNAc糖基化修饰过程的糖基供体为UDP-GlcNAc,该化合物是己糖胺合成途径(HBP)的终产物,在生物体中约有3%~5%的葡萄糖进入HBP途径[10]。近年来研究证实,在多种实体肿瘤中都存在O-GlcNAc修饰以及关键酶的异常[11]

早在2002年,Konrad等[12]就提出了Alloxan是OGT的特异性抑制剂。在后续研究中,该理论得到了Lee等[13]、Gurel等[14]研究结果的证实。Xu等[15]研究发现在高糖及氧化损伤的视网膜细胞存在蛋白的O-GlcNAc糖基化程度增高,在用Alloxan干预后其O-GlcNAc糖基化修饰水平下降,并且可减少高糖以及高氧环境对细胞的损伤。本研究采用Nalm-6细胞作为研究对象,证明了Alloxan能够降低细胞的O-GlcNAc修饰水平,可以用来构建低O-GlcNAc修饰的细胞模型。

Kim等[16]发现在宫颈癌细胞中存在O-GlcNAc修饰的异常,其中异常修饰的宿主细胞因子HCF-1可影响人乳头瘤病毒(HPV)的E6以及E7癌基因蛋白的表达并影响宫颈癌的发生发展;用siRNA干扰OGT表达可以明显降低E6以及E7蛋白的表达,细胞的增殖、侵袭、转移也被显著抑制。本研究应用OGT抑制剂Alloxan作用于Nalm-6细胞,证明Alloxan可以明显抑制Nalm-6细胞的增殖并诱发细胞凋亡。

Vp16是作用于细胞周期的特异性抗肿瘤药物,其作用靶点为DNA拓扑异构酶Ⅱ,影响DNA修复。本研究结果表明,Vp16作用于Nalm-6细胞可导致总蛋白O-GlcNAc修饰程度增加并伴随着OGT表达上调。那么Vp16为何会上调OGT表达?研究表明Vp16在杀伤细胞的同时可以影响细胞内的糖代谢。Demel等[17]曾研究发现Vp16可以增加糖代谢相关蛋白葡萄糖转运蛋白-1(Glut1)和已糖激酶2(HKII)的表达,并且,Ferrer等[18]证实OGT和Glut1的关系也非常密切,该文献中指出Glut1在OGT调控代谢方面有至关重要的作用,所以,笔者推测,当Vp16处理Nalm-6细胞后可能导致Glut1表达升高,进而导致糖代谢改变从而上调OGT的表达以及O-GlcNAc糖基化程度。

Stacey等[19]应用时差显微成像技术研究证明Vp16对处于S期到G2期的细胞的杀伤作用是G1期的2~3倍。可见,Vp16对细胞的杀伤作用与处于分裂期的细胞比例密切相关。近年来,研究证实抑制OGT的活性可以阻断cyclin D1蛋白的合成以及细胞增殖,并降低细胞周期相关蛋白PI3K和MAPK蛋白的表达。在本研究中,Alloxan抑制Nalm-6细胞OGT活性后,G1期细胞比例增多,S期细胞比例减少,而更重要的是,Alloxan可明显减少Vp16所致的Nalm-6细胞凋亡,同时伴随着促凋亡蛋白Bax表达上调和抑凋亡蛋白Bcl-2表达下调,推测该现象可能与Alloxan改变细胞周期从而减少了Vp16药物有效作用的细胞比例并进一步调节凋亡相关蛋白Bax及Bcl-2相关。

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关键词
主题词
Nalm-6细胞
O-GlcNAc
乙酰氨基葡萄糖转移酶
依托泊苷
糖基化