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短篇论著
RNA干扰沉默EZH2基因对HL-60细胞增殖、凋亡及组蛋白甲基化、乙酰化的影响
中华血液学杂志, 2017,38(03): 249-252. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-2727.2017.03.016
摘要
引用本文: 林璐慧, 黄轶群, 马旭东. RNA干扰沉默EZH2基因对HL-60细胞增殖、凋亡及组蛋白甲基化、乙酰化的影响 [J]. 中华血液学杂志,2017,38( 3 ): 249-252. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-2727.2017.03.016
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EZH2基因是Polycomb group基因家族的重要成员之一。Polycomb家族是一类调节组蛋白修饰的酶类,共形成PRC1和PRC2两个复合物,其中PRC2主要包括3个成员:EZH2、EED和SUZ12,特异性完成H3K27三甲基化修饰。在肿瘤细胞中,EZH2作为一个专门高度沉默包括抑癌基因在内的一系列靶基因的转录抑制因子,在多种肿瘤组织中高表达,如前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、大肠癌、肝细胞癌、淋巴瘤等。EZH2表达的增加与肿瘤的进展及预后相关[1]。本研究我们通过干扰RNA(siRNA)沉默人急性早幼粒白血病细胞株HL-60细胞EZH2基因,分析EZH2基因对HL-60细胞增殖、凋亡及组蛋白甲基化、乙酰化的影响,探讨EZH2基因在髓系白血病靶向治疗中的可能性。

材料与方法
1.细胞来源及培养:

人急性早幼粒白血病细胞株HL-60细胞购自中国科学院上海细胞库,用含10% FBS的RPMI 1640培养基置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的孵箱中进行培养,细胞自复苏后每2~3 d传代1次,取对数生长期细胞进行实验。

2.主要试剂:

RPMI 1640培养基、WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司;FBS购自杭州四季青生物制品公司;DNA Marker及RT-PCR试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;PCR引物、LipofectamineTM 2000转染试剂及RNA提取试剂盒均购自美国Invitrogen公司;Opti-MEM试剂购自美国Gibco公司;EZH2、β-actin、pro-caspase-3、pro-caspase-9、Bcl-2、Bax、二甲基化H3K27、三甲基化H3K27、乙酰化H3一抗及辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠、羊抗兔二抗均购自美国Upstate公司。流式细胞术相关试剂盒购自美国BD公司。

3. siRNA转染:

针对EZH2区域选择作用靶点,根据确定序列的原则设计,委托上海吉玛制药技术有限公司选择合成3条靶序列,预实验结果显示EZH2-homo-2167 siRNA效率最高,转染率为(82±3)%。其正义链为5′-GAGGGAAAGU GUAUGAUAATT-3′,反义链为5′-UUAUCAUACACUU UCCCUCTT-3′。确定该序列用于本研究。同时合成随机阴性对照序列和含荧光标志的通用随机阴性序列用于计算转染率。将稀释后的LipofectamineTM 2000室温放置5 min后与稀释的EZH2 siRNA混合并室温放置20 min形成转染复合物。转染前取对数生长期HL-60细胞悬浮于无抗生素培养基,转染时细胞密度达到(8~16)×105/ml,接种于96孔板,每孔2×104个细胞,终体积为100 μl。对照组未加转染复合物,实验组分别加入不同浓度转染复合物使EZH2 siRNA终浓度分别为30、60、120 nmol/L。每组设6个平行孔,每孔终体积为2 ml。转染后置37 ℃、5% CO2、饱和湿度的孵箱中继续培养24 h。

4. RT-PCR检测EZH2 mRNA的表达:

收集转染后HL-60细胞,用TRIzol法抽提总RNA。经紫外分光光度法鉴定、定量后,取总RNA 1 μg按逆转录试剂盒说明书操作合成cDNA并进行PCR扩增。引物序列:EZH2上游引物:5′-ACGGC TTCCCAATAACAGTAG-3′,下游引物:5′-TCAGATGGTGC CAGCAATAGA-3′,产物长度792 bp;β-actin上游引物:5′-CTCGTCATACTCCTGCTTGCT-3′,下游引物:5′-CGGGA CCTGACTGACTACCTC-3′,产物长度546 bp。反应条件:94 ℃ 2 min;94 ℃ 50 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共25个循环;72 ℃延伸8 min。PCR产物与上样缓冲液以6∶1混匀,在16 g/L琼脂糖凝胶上电泳,于凝胶图像分析仪上自动分析成像。实验重复3次。

5. WST-1法检测HL-60细胞增殖:

接种HL-60细胞至96孔板,每孔2×104个细胞,终体积为100 μl。实验组EZH2 siRNA的终浓度分别为30、60、90、120、150 nmol/L,对照组EZH2 siRNA的终浓度为0 nmol/L,并设空白组(加等体积培养液,不含细胞)。转染培养结束前4 h每孔加10 μl WST-1,继续培养4 h,充分混匀后在酶标仪上测450 nm和690 nm波长处吸光度(A)值,记录实验结果,并按以下公式计算细胞增殖率。实验重复3次。

细胞增殖率(%)=(A实验组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100%

6.流式细胞术检测HL-60细胞凋亡:

将HL-60细胞悬液接种于6孔板上,使细胞密度在转染时达到(8~16)×105/ml,终体积为2 ml,实验组EZH2 siRNA的终浓度分别为30、60、120 nmol/L,对照组EZH2 siRNA的终浓度为0 nmol/L,分别培养24 h后离心收集细胞。按照试剂盒说明书操作上流式细胞仪进行细胞凋亡检测。每次接种3个6孔板,实验重复3次。

7. Western blot法检测HL-60细胞凋亡相关蛋白及甲基化、乙酰化H3K27蛋白:

收集各组HL-60细胞,离心,预冷PBS洗涤2次后,去上清。按1×106细胞加入100 μl裂解液和1 μl酶抑制剂的比例裂解细胞30 min,低温10 000×g离心15 min,吸取中间清亮层。以120 g/L的SDS-PAGE分离,电转移法转膜,室温下摇床封闭1 h,加入TBS,根据一抗的不同稀释浓度,4 ℃过夜,TBS洗涤液洗膜后分别加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗,室温下摇床作用1 h,TBS洗涤液洗膜后化学发光法显色,X线胶片扫描后,用AlphaDigiDoc图像分析软件进行分析比较。实验重复3次。

8.统计学处理:

采用GraphPad Prism 5.0处理软件分析。常规进行方差齐性检验、正态性检验。计量资料实验数据以均数±标准差表示。多组资料组间的比较采用单因素方差分析,采用Dunnett法进行EZH2 siRNA处理组与对照组的两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。

结果
1. EZH2 siRNA对HL-60细胞EZH2表达的影响:

使用不同浓度EZH2 siRNA(30、60、120 nmol/L)转染细胞24 h后提取EZH2 mRNA及蛋白。RT-PCR结果显示,EZH2 siRNA处理组的mRNA条带亮度弱于对照组,且随着浓度增加呈递减趋势,其中120 nmol/L处理组亮度减弱最明显,提示随浓度增加抑制作用增强(图1)。用UV凝胶成像分析仪分析电泳结果:对照组EZH2 mRNA相对表达水平为1.069±0.647,30、60、120 nmol/L EZH2 siRNA处理组分别为0.713±0.093、0.677±0.568及0.492±0.078,组间差异有统计学意义(F=31.48,P<0.001),进一步采用Dunnett法进行两两比较,不同浓度EZH2 siRNA处理组EZH2 mRNA均低于对照组(P值均<0.01)。Western blot法结果显示,EZH2 siRNA组的EZH2蛋白表达随EZH2 siRNA浓度增加而降低(图2)。相对表达水平:对照组为0.967±0.610,30、60、120 nmol/L EZH2 siRNA处理组分别为0.793±0.080、0.447±0.057及0.144±0.060,组间差异有统计学意义(F=95.13,P<0.001),进一步采用Dunnett法进行两两比较,不同浓度EZH2 siRNA组EZH2蛋白表达均低于对照组(P值均<0.05)。

图1
RT-PCR检测EZH2干扰RNA(siRNA)处理HL-60细胞24 h后EZH2 mRNA的表达

M:Marker;1:对照组;2~4分别为30、60、120 nmol/L EZH2 siRNA处理组

图1
RT-PCR检测EZH2干扰RNA(siRNA)处理HL-60细胞24 h后EZH2 mRNA的表达
图2
Western blot法检测EZH2干扰RNA(siRNA)处理HL-60细胞24 h后EZH2蛋白的表达

1:对照组;2~4分别为30、60、120 nmol/L EZH2 siRNA处理组

图2
Western blot法检测EZH2干扰RNA(siRNA)处理HL-60细胞24 h后EZH2蛋白的表达
2. EZH2 siRNA对HL-60细胞增殖的抑制作用:

经终浓度分别为0、30、60、90、120、150 nmol/L的EZH2 siRNA作用24 h后,HL-60细胞的增殖率分别为(97.44±2.01)%、(87.53±4.13)%、(70.22±4.11)%、(62.54±3.14)%、(28.41±3.78)%、(15.24±4.80)%,随EZH2 siRNA浓度的增加,细胞增殖率逐渐下降,表现出浓度依赖性。组间差异有统计学意义(F=223.99,P<0.001),进一步采用Dunnett法进行两两比较,不同浓度EZH2 siRNA对HL-60增殖的抑制作用与对照组比较差异均有统计学意义(P值均<0.05)。

3. EZH2 siRNA对HL-60细胞凋亡的影响:

经终浓度30、60、120 nmol/L EZH2 siRNA作用24 h后,HL-60细胞的凋亡率分别为(27.6±7.1)%、(53.8±8.6)%、(64.4±6.7)%,而对照组HL-60细胞凋亡率为(2.8±1.7)%,随EZH2 siRNA浓度的增加,凋亡率逐渐上升,表现为浓度依赖性。组间差异有统计学意义(F=53.38,P<0.001),进一步采用Dunnett法进行两两比较,不同浓度EZH2 siRNA对HL-60细胞的增殖抑制作用与对照组比较差异均有统计学意义(P值均<0.05)。

4. EZH2 siRNA对HL-60细胞凋亡相关蛋白的影响:

终浓度0、30、60、120 nmol/L EZH2 siRNA处理HL-60细胞24 h后,经Western blot检测,随着EZH2 siRNA终浓度的增加,pro-caspase-3、pro-caspase-9、Bcl-2表达减少,Bax表达增加(图3)。

图3
Western blot法检测EZH2干扰RNA(siRNA)处理HL-60细胞24 h后凋亡相关蛋白的表达

1:对照组;2~4分别为30、60、120 nmol/L EZH2 siRNA处理组

图3
Western blot法检测EZH2干扰RNA(siRNA)处理HL-60细胞24 h后凋亡相关蛋白的表达
5. EZH2 siRNA对HL-60细胞H3K27甲基化及乙酰化的影响:

与对照组相比,转染EZH2 siRNA后,随着siRNA作用浓度的增加EZH2蛋白表达递减,并下调H3K27的二甲基化、三甲基化水平,上调H3的乙酰化水平(图4)。

图4
Western blot法检测EZH2干扰RNA(siRNA)处理HL-60细胞24 h后组蛋白的表达

1:对照组;2~4分别为30、60、120 nmol/L EZH2 siRNA处理组

图4
Western blot法检测EZH2干扰RNA(siRNA)处理HL-60细胞24 h后组蛋白的表达
讨论

白血病系血液系统恶性肿瘤,是一类造血干细胞的恶性克隆性疾病,其发病是多因素、多阶段和多种基因突变协同作用的过程。近来研究发现EZH2在高危骨髓增生异常综合征患者及急性髓系白血病患者中的表达水平显著高于低危骨髓增生异常综合征患者及正常人,提示EZH2在髓系恶性肿瘤的发生发展中发挥重要作用[2]。EZH2有对干细胞特异基因的激活以及对很多抑癌基因如p16、p27和BRCA1等进行调控的作用。有研究发现,抑制EZH2的活性能在小鼠模型中抑制甚至完全阻断肿瘤的生长[3]。Choi等[4]研究表明EZH2参与p53调控的细胞周期,激活的p53通过抑制EZH2启动子的活性而抑制EZH2基因的表达,使细胞增殖变慢,细胞周期出现G/M期阻滞。Yang等[5]发现,长链基因间非蛋白质编码RNA高表达于肝癌细胞5′端区域,通过与EZH2相互作用介导PRC2复合物定位于p16、p27等细胞周期相关基因的启动子区域,催化组蛋白过度甲基化从而抑制p16、p27等表达,解除肝癌细胞G0/G1期阻滞,参与肝癌细胞的增殖调控。Tonini等[6]发现在胃癌细胞中,EZH2可减少转录因子与DNA的结合,抑制靶基因表达,作用于pRb2/p130蛋白C-末端与组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)相联的区域,从而恢复pRb2/p130-HDAC1复合物介导的细胞周期素A启动子的活性,最终促进细胞周期演进和恶性转变。本研究结果显示EZH2 siRNA转染髓系HL-60细胞后可阻滞细胞周期,从而抑制细胞增殖。随着EZH2 siRNA浓度的增高,细胞增殖率逐渐下降,呈浓度依赖性。

Moon等[7]研究表明,白血病患者Bcl-2的表达显著增加,且与不良临床预后呈相关性。文川等[8]发现急性白血病患儿,骨髓单个核细胞CREB和Bcl-2在基因转录和翻译水平的表达均明显高于非恶性血液系统疾病患儿。白血病的体外研究显示,Bcl-2高表达者明显延长白血病细胞生存时间,抑制或阻断多种因素引起的细胞凋亡[9]。我们的研究表明沉默EZH2基因后,抗凋亡蛋白Bcl-2及胱天蛋白酶pro-caspase-9、pro-caspase-3表达量减少,而促凋亡蛋白Bax表达量增加。说明沉默EZH2可诱导HL-60细胞株的凋亡,且对HL-60细胞株凋亡的影响可通过内源性-线粒体依赖途径完成的,亦不排除外源性-死亡受体途径参与的凋亡过程,机制有待进一步研究。

Cai等[10]在肝癌中发现,与正常肝组织相比,三甲基化H3K27在肝癌中高表达,且与肿瘤大小、血管浸润、肿瘤分期等因素相关,并发现三甲基化H3K27蛋白表达与肝癌患者预后有关,三甲基化H3K27表达越高的患者预后越差。Tzao等[11]研究发现三甲基化H3K27和H3K18ac在食管癌患者中高表达,且表达越高预后越差。急性髓系白血病(AML)是发生于造血干/祖细胞的恶性增殖性疾病。表观遗传学变异在白血病的发生、发展和转移中发挥重要作用。近年来,染色体甲基化异常逐渐成为AML研究的热点,AML中存在一组基因的高度甲基化,导致这些基因表达的沉默或抑制,从而促进正常造血干细胞向白血病细胞的转化。组蛋白甲基转移酶EZH2是特异性H3K27甲基转移酶,通过与DNA甲基转移酶(DNMT1)合作,致使靶基因CpG岛区DNA甲基化导致靶基因的永久性沉默,从而参与异染色质的形成及基因转录调控[12]。H3K27甲基化是一种抑制效应,与该位点乙酰化具有拮抗效应[13]。本实验我们通过EZH2 siRNA转染HL-60细胞后,EZH2基因特异性作用于组蛋白H3的第27位赖氨酸残基,下调组蛋白H3K27二甲基化及三甲基化,组蛋白H3乙酰化上调。H3K27甲基化是调控转录的重要的组蛋白修饰之一,高度表达二甲基化及三甲基化的H3K27可以抑制基因转录;反之使二甲基化及三甲基化的H3K27去甲基化可以激活基因转录。H3K27甲基化下调的同时伴有组蛋白H3乙酰化水平升高,我们推测这一组蛋白修饰的改变解除了H3K27甲基化在抑癌基因启动子区域的转录抑制作用,恢复细胞周期调控作用,同时Bcl-2表达下降,Bax表达增加,启动内源性-线粒体凋亡途径,从而达到抑制细胞分裂、促使细胞进入凋亡程序的目的。组蛋白H3K27通过甲基化及去甲基化过程参与基因转录调控,影响细胞增殖、凋亡,参与白血病发生。H3K27甲基化失平衡与AML的发生发展相关,通过纠正H3K27的甲基化异常,使高甲基化失活的抑癌基因再度表达,将有望为AML的治疗提供新的靶点。

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