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短篇论著
地西他滨对K562细胞增殖和TFPI-2基因表达的影响
中华血液学杂志, 2017,38(04): 340-343. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-2727.2017.04.016
摘要
引用本文: 王甫珏, 李君君, 谢海涛, 等.  地西他滨对K562细胞增殖和TFPI-2基因表达的影响 [J]. 中华血液学杂志,2017,38( 4 ): 340-343. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-2727.2017.04.016
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近年来研究发现异常的表观遗传学修饰是肿瘤发生的早期事件,基因甲基化修饰改变是血液淋巴系统肿瘤发生的关键步骤之一[1]。组织因子途径抑制物-2(tissue factor pathway inhibitor-2,TFPI-2)是一种Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制物,具有广谱丝氨酸蛋白酶抑制物作用,是一个非常重要的潜在抑癌基因[2]。研究报道,在多种肿瘤中存在TFPI-2基因启动子区域异常甲基化,导致TFPI-2基因表达减低,进而参与肿瘤的发生、发展、侵袭和转移[3]。有研究者在中国儿童急性髓系白血病(AML)患者中发现TFPI-2基因启动子区域存在高频率甲基化,其基因表达水平显著降低[4,5],但该基因在AML疾病发生、发展及预后中的作用及与抗肿瘤化疗药物的靶向作用机制仍不清楚。本研究我们探讨地西他滨治疗AML的分子机制并寻找其新的调控基因。

材料与方法
1.主要试剂与仪器:

K562细胞株来自中南大学生命科学学院,购自美国模式培养物保藏所(ATCC);地西他滨购自正大天晴药业集团股份有限公司;CCK-8试剂盒为Vazyme公司产品;基因组DNA提取试剂盒、小分子量DNA Marker购自生工生物工程(上海)股份有限公司;EZ DNA甲基化试剂盒(Lighting试剂盒)及Zymo Taq酶购自北京天漠科技开发有限公司;β-actin及TFPI-2抗体均为博奥森公司产品;RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis kit购自赛默飞公司;2×Power Taq PCR MasterMix为北京百泰克生物技术有限公司产品;PCR扩增仪为美国Bio-Rad DNA Engine Peltier Thermal Cycle;流式细胞仪为美国Beckman公司产品。

2.骨髓单个核细胞分离及其TFPI-2基因甲基化水平检测:

经患者知情同意后,收集南华大学附属第一医院血液科2014年4月至2015年6月期间33例初诊AML患者骨髓标本,以16例缺铁性贫血(IDA)患者的骨髓标本作为对照组,所有IDA患者均已排除肿瘤因素。取骨髓液2 ml,加入等量PBS混匀,加至淋巴细胞分离液表面,400×g离心20 min后,吸取白色细胞层,PBS洗涤细胞2次,弃上清液,对其进行相应处理后冻存于-80 ℃冰箱备用。

基因组DNA提取操作参考生工生物工程(上海)股份有限公司小量柱式基因组DNA提取试剂盒说明书。DNA甲基化修饰参照Zymo公司EZ DNA Methylationg-Lighting Kit操作步骤,回收DNA溶于10 μl M-Elution缓冲液中,储存于-20 ℃。TFPI-2甲基化引物(M)及非甲基化引物(U)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。TFPI-2甲基化引物正义链:5'-TTTCGTATAAAGCGGGTATTC-3',反义链:5'-ACGACCCGCTAAACAAAACG-3'(PCR产物片段95 bp);TFPI-2非甲基化引物正义链:5'-GGATGTTTGTTTTGTATAAAGTG-3',反义链:5'-AAACAT CCAAAAAAACACCTAAC-3'(PCR产物片段89 bp)。甲基化扩增体系总体积为25 μl,其中Zymo Taq Premix 15 μl,正、反义引物各2 μl,模板100 ng,剩余体积用双蒸水补齐;反应条件:95 ℃预变性10 min,随后94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共40个循环,最后72 ℃延伸7 min,4 ℃维持4 min。用40 g/L琼脂糖凝胶100 V电泳35 min检测扩增产物,紫外灯下观察并摄像。

3.CCK-8法检测细胞存活率:

取对数增殖期K562细胞,接种于96孔板中,细胞密度为8×104/ml,每孔100 μl。设3个(2、5、10 μmol/L)地西他滨浓度实验组,并设阴性对照组,每组设4个复孔,共接种4张板,分别培养0、24、48、72 h后在酶标仪上测定450 nm波长下各孔吸光度(A)值,每次检测前2 h分别于每孔加入10 μl CCK-8反应试剂,继续培养2 h,其中0 h板在种板后即加入CCK-8试剂,并放入培养箱培养2 h后检测A值,结果取各重复孔平均数。每次实验重复3次,结果取各重复孔平均值。按以下公式计算细胞存活率:细胞存活率(%)=(A实验组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100%。绘制不同浓度地西他滨和不同处理时间后的存活率点线图。使用锥虫蓝染色计数法分别计数0、24、48、72 h各组活细胞数,取其平均值。

4.TFPI-2蛋白表达的检测:

不同浓度地西他滨处理K562细胞48 h后收集细胞,PBS洗涤2次,加入RIPA与PMSF混合液(96∶4)200 μl,冰上裂解细胞30 min,4 ℃ 12 000 r/min(离心半径9 cm)离心5 min,取上清液至0.5 ml离心管中,取上清使用BCA蛋白定量试剂盒测定样品蛋白含量。然后,细胞蛋白提取液与5×蛋白上样缓冲液以4∶1体积比混匀,PCR仪中99 ℃加热5 min后离心机短暂离心,然后用提取的蛋白进行SDS-PAGE,100 V恒压电泳2 h,电泳结束后将所需的条带切下,冰上200 mA恒流电转90 min,使分离的条带转移至PVDF膜上,将PVDF膜置于50 g/L脱脂牛奶中室温封闭2 h,加入TFPI-2多克隆抗体后在摇床上室温孵育1 h,然后4 ℃过夜,次日TBST漂洗膜10 min,共3次,加入二抗后在摇床上室温孵育1 h,TBST漂洗膜10 min,共3次,采用化学发光法显影。

5.流式细胞术检测细胞周期和凋亡:

收集5 μmol/L地西他滨处理48 h的实验组和对照组细胞,用PBS洗涤2次,调整细胞密度,加入5 μl RNAase A,37 ℃孵育30 min;再加入125 μl PI染液,4 ℃避光孵育30 min,上机检测K562细胞周期参数。此外,加入100 μl结合缓冲液重悬细胞,加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI,避光,室温下反应10 min,再加入400 μ1结合缓冲液混匀,上机检测K562细胞凋亡情况。

6.统计学处理:

数据分析采用SPSS16.0软件进行。实验重复3次,数据采用±s表示。AML与IDA患者骨髓中的甲基化发生率的比较采用卡方检验;CCK-8及细胞计数的均数比较采用单因素方差分析,检验水准α=0.05,方差分析有统计学意义之后的组间两两比较采用LSD法。

结果
1.TFPI-2基因在初治AML患者骨髓中的甲基化情况:

甲基化特异性PCR(MS-PCR)检测了33例初诊的AML患者骨髓单个核细胞TFPI-2基因的甲基化情况,结果显示21例(63.6%)患者该基因启动子区域完全甲基化与不完全甲基化阳性(图1),而在16例IDA患者中未检测到该基因甲基化发生。

图1
甲基化特异性PCR检测TFPI-2基因启动子甲基化状态

m:甲基化扩增产物;u:非甲基化扩增产物;M:Marker;1:对照组(缺铁性贫血患者);2~4:初诊AML患者

图1
甲基化特异性PCR检测TFPI-2基因启动子甲基化状态
2.地西他滨对K562细胞增殖的影响:

K562细胞随着地西他滨药物浓度增高,其细胞存活率呈下降趋势(图2),2、5、10 μmol/L浓度组在24、48、72 h各时间点与对照组相比差异均有统计学意义(P值均<0.001),此外,在24、48、72 h各组间细胞存活率差异有统计学意义(F值分别为24.056、99.484、104.089,P值均<0.001)。

图2
CCK-8检测不同浓度地西他滨处理K562细胞的存活率
图2
CCK-8检测不同浓度地西他滨处理K562细胞的存活率

锥虫蓝计数法检测结果显示在相同的时间点,随着地西他滨作用浓度增加,各组活细胞数呈下降趋势,在24、48、72 h时间点,各浓度组活细胞计数差异均有统计学意义(F值分别为9.222、17.037、42.935,P值分别为0.006、0.001、<0.001),各浓度组与对照组相比差异均具有统计学意义(P值均<0.05)。在各浓度组中,24 h活细胞计数与对照组相比,差异均无统计学意义(P值分别为0.067、0.211、0.382),而在48 h、72 h活细胞计数与对照组相比,差异均有统计学意义(P值均<0.001)。表明地西他滨对K562细胞的增殖抑制作用在一定范围内呈时间-剂量效应关系。详见图3

图3
细胞计数法检测地西他滨抑制K562细胞增殖作用
图3
细胞计数法检测地西他滨抑制K562细胞增殖作用
3.地西他滨处理K562细胞后对TFPI-2基因启动子甲基化的影响:

MS-PCR检测发现在K562细胞中TFPI-2基因呈不完全甲基化状态,经2、5、10 μmol/L地西他滨处理48 h后,K562细胞中TFPI-2基因启动子甲基化程度逐渐减低,呈浓度依赖性关系,在较高药物浓度(10 μmol/L)时,MS-PCR未能检测出TFPI-2基因甲基化扩增片段(图4)。

图4
甲基化特异性PCR检测不同浓度地西他滨处理K562细胞后TFPI-2基因甲基化状态

m:甲基化扩增产物;u:非甲基化扩增产物;M:Marker;1~4:0、2、5、10 μmol/L地西他滨作用组

图4
甲基化特异性PCR检测不同浓度地西他滨处理K562细胞后TFPI-2基因甲基化状态
4.地西他滨对K562细胞TFPI-2蛋白表达的影响:

经过2、5、10 μmol/L地西他滨处理K562细胞后,Western blot法检测其细胞内TFPI-2蛋白表达变化,结果显示在空白对照组TFPI-2蛋白呈低表达,经不同浓度地西他滨处理后,TFPI-2蛋白表达增高,且呈浓度依赖性(图5)。

图5
Western blot法检测不同浓度地西他滨处理48 h后K562细胞TFPI-2蛋白表达水平

1~4分别为0、2、5、10 μmol/L地西他滨作用组

图5
Western blot法检测不同浓度地西他滨处理48 h后K562细胞TFPI-2蛋白表达水平
5.地西他滨对K562细胞周期和凋亡的影响:

与空白对照组比较,5 μmol/L地西他滨处理K562细胞48 h后,处于G0/G1期细胞由32.51%增至43.30%,G2/M期细胞由14.02%增至28.28%,S期细胞由48.85%减少至32.49%,提示地西他滨使K562细胞周期阻滞于G0/G1和G2/M期,从而抑制细胞的增殖。此外,地西他滨处理48 h后,K562细胞的早期凋亡细胞百分比由空白对照组的1.44%上升至2.78%,提示地西他滨对K562细胞凋亡的诱导作用较弱。

讨论

表观遗传失调是许多肿瘤包括AML的发病机制之一,基因启动子区域CpG岛位点甲基化介导的抑癌基因失活在AML的发生发展中扮演重要角色[6,7]。TFPI-2作为一重要的抑癌基因,已经被证实在多种恶性肿瘤细胞中由于启动子区域CpG岛位点甲基化引起TFPI-2蛋白表达显著减低,导致肿瘤细胞的侵袭转移能力显著增强[8]。研究发现TFPI-2不但能调控肿瘤细胞的侵袭转移,而且与肿瘤细胞的增殖也密切相关[9]。本研究结果显示初诊的AML患者TFPI-2基因启动子甲基化的发生率为63.6%,与邵丽丽等[4]报道的AML患者TFPI-2基因甲基化发生率64.63%基本一致。AML患者TFPI-2表达水平明显减低,且患者TFPI-2基因的表达水平与患者临床分期及疾病预后相关,即TFPI-2表达水平越低,化疗效果越差。

地西他滨是一种DNA甲基化转移酶抑制剂,能够通过去除异常的甲基化而恢复抑癌基因的表达,从而实现抗肿瘤的作用,在临床上已经被应用于骨髓增生异常综合征(MDS)的治疗中,同时在AML的前期临床试验研究中,也表现出显著疗效,但其调控靶分子及抗白血病的分子机制仍不完全清楚[10]。本实验结果显示,10 μmol/L地西他滨对K562细胞中TFPI-2基因启动子去甲基化效率最高,与部分文献报道的5 μmol/L浓度有差异,可能与以下因素有关:实验使用的地西他滨是小剂量包装的临床药品,其纯度和药物活性分子可能与专用的科研试剂存在差异;此外,不同细胞株对地西他滨的药物反应也可能存在差异。TFPI-2基因启动子高度甲基化状态被逐渐解除,去甲基作用随地西他滨浓度增高和处理时间延长而增强,细胞内TFPI-2蛋白表达水平呈时间与浓度依赖性升高。Hamamoto等[11]研究发现地西他滨能使非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)内TFPI-2基因启动子去甲基化,使其基因表达水平增高,然后再通过高表达的TFPI-2抑制TMPRSS4基因转录,导致NSCLC细胞增殖显著受抑。地西他滨对K562细胞有显著的增殖抑制作用,且随药物浓度的增加和作用时间的延长,其细胞增殖抑制作用越来越显著,与对照组比较K562细胞分裂周期受阻、凋亡细胞略有增加,结果提示地西他滨抑制K562细胞增殖可能主要通过调控K562细胞周期而实现。Weeks等[12]发现在儿童急性B淋巴细胞白血病中,地西他滨通过使TES基因启动子去甲基化,恢复该基因的表达水平后,白血病细胞通过非TP53活性依赖方式诱导细胞凋亡及细胞周期受阻调控B淋巴细胞白血病细胞的增殖。刘进等[13]发现地西他滨解除急性T淋巴细胞白血病细胞株Molt4细胞中乳铁蛋白(LTF)基因启动子CpG岛甲基化后,能有效抑制Molt4细胞的增殖,抑制率呈时间和剂量依赖性增加,使细胞周期阻滞于G0/G1期,并能诱导细胞凋亡。

总之,TFPI-2基因在AML疾病发生发展过程中可能发挥重要的负调节作用。地西他滨能有效抑制K562细胞增殖,部分原因可能与其解除TFPI-2基因启动子甲基化效应,恢复TFPI-2基因表达相关,因而,本研究结果可为深入阐明地西他滨治疗AML的分子机制提供新的实验数据。

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