66
阅读
0
评论
分享
短篇论著
多发性骨髓瘤患者外周血髓源抑制性细胞的初步研究
中华血液学杂志, 2017,38(06): 545-547. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-2727.2017.06.016
摘要
引用本文: 周林, 祁双, 严成, 等.  多发性骨髓瘤患者外周血髓源抑制性细胞的初步研究 [J]. 中华血液学杂志,2017,38( 6 ): 545-547. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-2727.2017.06.016
正文
作者信息
基金  关键词  主题词
English Abstract
评论
阅读 66 引用 0
相关资源
视频 0 论文 0 大综述 0
以下内容和版式版权归属中华医学会,未经授权不得转载 ×

多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是一种克隆性浆细胞异常增殖的最常见血液系统恶性肿瘤,年发病率约为4.3/10 000[1]。其临床症状主要表现为贫血、骨质破坏、肾损伤和高钙血症等,尤其好发于中老年人群。髓源抑制性细胞(myeloid derived suppressor cells,MDSC)是一群髓系来源的具有免疫抑制功能的异质性细胞群体,根据分化来源不同可分为粒细胞系MDSC(PMN-MDSC)和单核细胞系MDSC(M-MDSC),其表面标记分别为CD11b+CD33+CD14-CD15+和CD11b+CD33+CD14-CD15-[2]。近年来研究发现多种实体瘤患者外周血MDSC表达明显上调[3],但其在MM中的表现尚不清楚。本研究我们采用流式细胞术检测32例MM患者和20名健康人外周血PMN-MDSC和M-MDSC表达,并用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测MDSC相关细胞因子精氨酸酶1(ARG1)、诱发型一氧化氮合酶(iNOS)和血管内皮生长因子(VEGF)基因mRNA表达水平,同时检测MM患者外周血滤泡辅助性T细胞(Tfh)、调节性T细胞(Treg)、辅助性T细胞(Th)、细胞毒性T细胞(Tc)、自然杀伤细胞(NK)及B淋巴细胞的比例。

材料与方法
1. 病例:

2014年1月至2015年7月于江苏省苏北人民医院诊断为MM的患者,其中男21例、女11例,中位年龄64(45~81)岁。ISS分期:Ⅰ期6例,Ⅱ期11例,Ⅲ期15例。免疫学分型:IgG型14例,IgA型7例,IgM型2例,游离轻链型λ、κ型分别为6、3例。所有患者都符合国际骨髓瘤工作组(IMWG)诊断标准[4]。以20名健康体检者作为正常对照组,男16例、女4例,中位年龄57(45~61)岁。

2. 主要设备与试剂:

流式细胞分析仪(FACS Canto Ⅱ)为美国BD公司产品,实时荧光定量PCR仪(CFX-96 real-time cycler)为美国BIO-Rad公司产品,梯度PCR仪为德国Eppendorf公司产品,普通PCR仪(ABI2720)、高速冷冻离心机为美国Thermo Fisher公司产品。抗人CD14-PE、抗人CD11b-FITC、抗人CD15-APC、抗人CD33-PE-Cyanine5为美国Ebioscience公司产品,逆转录试剂Hiscript Q RT SuperMix、实时荧光定量试剂Cham Q SYBR QPCR Master Mix为中国Vazyme Biotech公司产品。

3. 标本采集和制备:

采集初诊MM患者和健康体检者外周静脉血3 ml,EDTA-2K抗凝,先进行全血细胞计数分析,然后取部分全血进行流式标记、检测分析,剩余全血标本以2 862×g离心10 min,分离上层血浆和下层血细胞,然后分别用EP管分装,-80 ℃冻存。全血细胞用于qRT-PCR检测,血浆用于常规生化指标检测。

4. 流式细胞术检测MDSC及淋巴细胞亚群:

①MDSC表面标记[5]:PMN-MDSC:CD14-CD11b+CD33+CD15+;M-MDSC:CD14-CD11b+CD33+CD15-。②淋巴细胞亚群表面标记[6]:Tfh细胞:CD4+CXCR5+ICOS+;Th细胞:CD3+CD4+;Tc细胞:CD3+CD8+;B细胞:CD3-CD19+;NK细胞:CD3-CD16+CD56+;Treg细胞:CD4+CD25+CD127LOW/-

5.qRT-PCR检测外周全血细胞ARG1、iNOS和VEGF基因mRNA表达:

TRizol法提取外周全血细胞总RNA,逆转录成cDNA,再用qRT-PCR检测相关基因相对表达量。引物设计参见文献[7],以β-actin作为内参,由南京金斯瑞生物科技有限公司合成(表1)。反应体系10 μl:SYBR Green 5 μl,上下游引物各0.2 μl,双蒸水4.1 μl,cDNA 0.5 μl。反应条件:预变性95 ℃ 30 s,变性95 ℃5 s,退火61 ℃ 30 s,延伸72 ℃30 s,40个循环。mRNA表达量采用相对定量分析法计算。

表1

实时荧光定量PCR检测ARG1、iNOS和VEGF基因mRNA表达引物序列[7]

表1

实时荧光定量PCR检测ARG1、iNOS和VEGF基因mRNA表达引物序列[7]

基因引物序列(5′ →3′)产物大小(bp)
上游下游
ARG1GTTTCTCAAGCAGACCAGCCGCTCAAGTGCAGCAAAGAGA149
iNOSATTCTGCTGCTTGCTGAGGTTTCAAGACCAAATTCCACCAG138
VEGFCACACAGGATGGCTTGAAGAAGGGCAGAATCATCACGAAG136
β-actinCACGAAACTACCTTCAACTCCCATACTCCTGCTTGCTGATC265

注:ARG1:精氨酸酶1;iNOS:诱发型一氧化氮合酶;VEGF:血管内皮生长因子

6. 统计学处理:

数据分析采用SPSS 21.0软件,结果以±s表示。统计学方法采用参数的非配对的独立样本t检验,方差不齐则采用近似t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结果
1. 流式细胞术检测MM患者和正常对照组外周血MDSC:

MM患者外周血PMN-MDSC比例高于正常对照组[(65.72±12.10)%对(51.10±3.53)%,t=5.240,P<0.001],M-MDSC差异无统计学意义[(0.49±0.31)%对(0.42±0.31)%,t=0.869,P=0.389]。

2. 流式细胞术检测MM患者和正常对照组外周血淋巴细胞亚群:

MM患者外周血Tfh、Treg、Tc细胞比例高于正常对照组(P<0.001,P<0.001,P=0.004),Th/Tc细胞比值降低(P=0.024)。两组Th、NK和B淋巴细胞比例差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2

表2

多发性骨髓瘤(MM)患者和正常对照组外周血淋巴细胞亚群检测结果(±s

表2

多发性骨髓瘤(MM)患者和正常对照组外周血淋巴细胞亚群检测结果(±s

组别例数Tfh细胞(%)Treg细胞(%)Tc细胞(%)Th/Tc细胞比值Th细胞(%)NK细胞(%)B细胞(%)
MM组326.33±1.6110.81±2.1838.36±8.101.05±0.5937.76±13.4117.07±3.2110.20±1.77
正常对照组203.59±0.497.50±1.6231.51±7.831.39±0.4539.35±8.6718.01±3.329.87±1.75
t值 8.9408.9303.000-2.332-0.471-1.0100.647
P值 <0.001<0.0010.0040.0240.6390.3170.520

注:Tfh:滤泡辅助性T细胞;Treg:调节性T细胞;Th:辅助性T细胞;Tc:细胞毒性T细胞;NK:自然杀伤细胞

3. 外周全血细胞ARG1、iNOS和VEGF基因mRNA表达水平:

MM患者外周全血细胞ARG1、iNOS、VEGF基因mRNA表达水平均高于正常对照组(P<0.001),详见表3

表3

多发性骨髓瘤(MM)患者和正常对照组外周全血细胞ARG1、iNOS和VEGF基因mRNA相对表达量(±s

表3

多发性骨髓瘤(MM)患者和正常对照组外周全血细胞ARG1、iNOS和VEGF基因mRNA相对表达量(±s

组别例数ARG1iNOSVEGF
MM组321.76±0.032.12±0.091.63±0.10
正常对照组201.21±0.121.47±0.231.27±0.07
t值 24.8514.3914.07
P值 <0.001<0.001<0.001

注:ARG1:精氨酸酶1;iNOS:诱发型一氧化氮合酶;VEGF:血管内皮生长因子

讨论

MDSC是一群髓系来源的具有免疫抑制功能的异质性细胞群体,由造血祖细胞、未成熟的巨噬细胞、未成熟的粒细胞和未成熟树突状细胞等细胞组成。研究表明在炎症、肿瘤等病理条件可使其异常增殖[8]。已有的研究结果发现PMN-MDSC在MM患者骨髓中显著升高[5],本研究结果与上述研究一致。目前,MDSC的定义仍存争议[9]。Wang等[10]研究发现MM患者M-MDSC显著升高且与疾病进展及疗效相关,本组MM患者外周血M-MDSC比例与正常对照组差异无统计学意义,可能与MDSC定义不同有关。

MDSC的免疫抑制功能主要通过抑制T细胞的增殖和活化、抑制NK细胞的天然杀伤作用、活化Th17细胞和Treg细胞等方式促进肿瘤的免疫耐受和免疫逃逸[11]。本研究结果表明,MM患者外周血T细胞亚群比例失调,Th细胞和Tc细胞的比值显著降低,Treg细胞比例显著升高。Tfh细胞是真正具有辅助B细胞活化功能的T细胞亚群[12]。本组MM患者外周血Tfh比例显著升高,但B淋巴细胞比例却只有轻度上升,造成这一现象的机制有待进一步研究。同时,本组MM患者外周血NK细胞比例轻度下降,是否与MDSC有关还需研究,但以上免疫细胞变化进一步证明了在MM患者外周血中存在严重的细胞免疫功能的失调。

现有的研究认为,MDSC在多种实体瘤中实现免疫抑制的机制主要是通过释放ARG1、iNOS、VEGF、活性氧(ROS)以及释放IL-6、IL-10、TNF-β等细胞因子来抑制T细胞的增殖和活化[3,13,14]。此外,MDSC还通过释放过氧亚硝酸盐来抑制Tc细胞的免疫功能[15],但MM患者MDSC异常增殖及其免疫抑制机制仍未阐明。ARG1、iNOS和VEGF都是MDSC相关细胞因子[7, 11],因此,本研究小组进一步研究了MM患者外周全血细胞ARG1、iNOS和VEGF基因mRNA表达。研究结果显示,MM患者外周全血细胞ARG1和iNOS基因mRNA表达水平显著升高。ARG1和iNOS的上调可导致L-精氨酸的消耗增加,从而引起T细胞的增殖功能受到抑制,而且其产物一氧化氮能够直接加快T细胞的凋亡[16]。因此,MM患者外周全血细胞ARG1和iNOS基因高表达不仅提示MDSC的上调,而且还提示在MM患者中也存在类似的T细胞增殖、活化功能受抑机制。

本研究结果还显示初诊MM患者外周全血细胞VEGF基因mRNA表达显著升高。以往研究表明,VEGF能够促进造血祖细胞(HPC)分化为MDSC[11]。我们由此推测VEGF高表达可能促进了MM患者MDSC的增殖,但VEGF与其他免疫细胞之间的作用机制有待进一步研究。MM患者MDSC与细胞因子ARG1、iNOS、VEGF变化的相关性也需要进一步研究证实。

参考文献
[1]
KyleRA, RajkumarSV. Multiple myeloma[J]. Blood, 2008, 1116):2962-2972. DOI: 10.1182/blood-2007-10-078022.
[2]
GabrilovichDI, NagarajS. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system[J]. Nat Rev Immunol, 2009, 93):162-74. DOI: 10.1038/nri2506.
[3]
SolitoS, MarigoI, PintonL, et al. Myeloid-derived suppressor cell heterogeneity in human cancers[J]. Ann N Y Acad Sci, 2014, 1319:47-65. DOI: 10.1111/nyas.12469.
[4]
RajkumarSV, DimopoulosMA, PalumboA, et al. International Myeloma Working Group updated criteria for the diagnosis of multiple myeloma[J]. Lancet Oncol, 2014, 1512):e538-548. DOI: 10.1016/S1470-2045(14)70442-5.
[5]
RamachandranIR, MartnerA, PisklakovaA, et al. Myeloid-derived suppressor cells regulate growth of multiple myeloma by inhibiting T cells in bone marrow[J]. J Immunol, 2013, 1907):3815-3823. DOI: 10.4049/jimmunol.1203373.
[6]
PallikkuthS, ParmigianiA, SilvaSY, et al. Impaired peripheral blood T-follicular helper cell function in HIV-infected nonresponders to the 2009 H1N1/09 vaccine[J]. Blood, 2012, 1205):985-993. DOI: 10.1182/blood-2011-12-396648.
[7]
LechnerMG, LiebertzDJ, EpsteinAL. Characterization of cytokine-induced myeloid-derived suppressor cells from normal human peripheral blood mononuclear cells[J]. J Immunol, 2010, 1854):2273-2284. DOI: 10.4049/jimmunol.1000901.
[8]
TrikhaP, CarsonWE 3rd. Signaling pathways involved in MDSC regulation[J]. Biochim Biophys Acta, 2014, 18461):55-65. DOI: 10.1016/j.bbcan.2014.04.003.
[9]
DamuzzoV, PintonL, DesantisG, et al. Complexity and challenges in defining myeloid-derived suppressor cells[J]. Cytometry B Clin Cytom, 2015, 882):77-91. DOI: 10.1002/cyto.b.21206.
[10]
WangZ, ZhangL, WangH, et al. Tumor-induced CD14+HLA-DR(-/low)myeloid-derived suppressor cells correlate with tumor progression and outcome of therapy in multiple myelomapatients[J]. Cancer Immunol Immunother, 2015, 643):389-399. DOI: 10.1007/s00262-014-1646-4.
[11]
MalekE, de LimaM, LetterioJJ, et al. Myeloid-derived suppressor cells: the green light for myeloma immune escape[J]. Blood Rev, 2016, 305):341-348. DOI: 10.1016/j.blre.2016.04.002.
[12]
MesquitaD, CruvinelWM, ResendeLS, et al. Follicular helper T cell in immunity and autoimmunity[J]. Braz J Med Biol Res, 2016, 495):e5209. DOI: 10.1590/1414-431X20165209.
[13]
BronteV, ZanovelloP. Regulation of immune responses by L-arginine metabolism[J]. Nat Rev Immunol, 2005, 58):641-654. DOI: 10.1038/nri1668.
[14]
RodríguezPC, OchoaAC. Arginine regulation by myeloid derived suppressor cells and tolerance in cancer: mechanisms and therapeutic perspectives[J]. Immunol Rev, 2008, 222:180-191. DOI: 10.1111/j.1600-065X.2008.00608.x.
[15]
NagarajS, GuptaK, PisarevV, et al. Altered recognition of antigen is a mechanism of CD8+ T cell tolerance in cancer[J]. Nat Med, 2007, 137):828-835. DOI: 10.1038/nm1609.
[16]
CondamineT, GabrilovichDI. Molecular mechanisms regulating myeloid-derived suppressor cell differentiation and function[J]. Trends Immunol, 2011, 321):19-25. DOI: 10.1016/j.it.2010.10.002.
 
 
关键词
主题词