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短篇论著
L型PML-RARα融合基因不同剪接体对ATO作用敏感性的研究
中华血液学杂志, 2017,38(06): 554-556. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-2727.2017.06.019
摘要
引用本文: 薛凤, 覃艳红, 任方刚, 等.  L型PML-RARα融合基因不同剪接体对ATO作用敏感性的研究 [J]. 中华血液学杂志,2017,38( 6 ): 554-556. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-2727.2017.06.019
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急性早幼粒细胞白血病(APL)特征性标志是染色体t(15;17)(q22;q21)易位,并形成PML-RARα融合基因[1,2,3]。本课题组前期研究发现,PML基因第5、6外显子存在选择性剪接,可形成E5(+)E6(+)(第5外显子和第6外显子均存在)、E5(-)E6(+)(第5外显子缺失)、E5(-)E6(-)(第5外显子和第6外显子均缺失)三种不同的剪接转录本,E5(-)E6(-)剪接体表达量高的患者预后差,三种剪接体对全反式维甲酸(ATRA)表现出不同的敏感性,可能是由于E5(-)E6(-)剪接体失去核定位信号而导致胞质定位,从而表现出对ATRA作用的敏感性较其他两种剪接体差[4,5]

治疗APL的另一靶向药物三氧化二砷(ATO)有明确的抗白血病作用,主要通过作用于PML锌指结构域,使PML-RARα融合蛋白被类泛素样蛋白SUMO修饰,进而通过蛋白酶体途径降解来发挥作用[6,7]。那么对ATRA有不同敏感性的E5(+)E6(+)、E5(-)E6(+)和E5(-)E6(-)三种剪接体对ATO作用的敏感性如何?本研究我们以APL细胞系NB4细胞[8,9]为研究对象,采用实时荧光定量PCR法对不同剂量ATO诱导细胞凋亡和分化过程中剪接体E5(+)E6(+)、E5(-)E6(+)和E5(-)E6(-)相对表达量的变化进行研究,观察各剪接体对ATO作用的敏感性,现报道如下。

材料与方法
1. 研究材料及主要试剂:

人APL细胞系NB4细胞为本实验室长期保存。ATO购自美国Sigma公司;PBS缓冲液购自武汉博士德生物工程有限公司;青霉素、链霉素双抗购自北京全式金生物技术有限公司;RPMI 1640培养液购自美国Hyclone公司;Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司;RNA提取试剂盒购自美国Omega公司;M-MuLV逆转录酶、Premix Ex Taq均购自宝生物工程(大连)有限公司。

2.ATO溶液制备:

参照文献[10]方法,取60 mg ATO溶解于2 ml 1 mol/L的NaOH溶液中,PBS稀释至浓度为100 µmol/L,-20 ℃避光保存。

3. 实验分组:

实验分为对照组和不同浓度药物处理组,每组设0、24、48、72、96 h 5个观察时间点。取对数生长期状态良好的NB4细胞,按每孔1×106个细胞接种于6孔板。对照组各孔内加入含10% FBS及双抗的RPMI 1640培养液3 ml;药物处理组包括5组,分别加入含终浓度为0.1、0.2、1.0、1.5和2.0 µmol/L ATO的含10% FBS及双抗的RPMI 1640培养液3 ml。将各组细胞置于37 ℃、5% CO2培养箱内避光孵育。实验设2个复孔。

4. 流式细胞术检测细胞凋亡及分化情况:

在培养0、24、48、72、96 h 5个时间点,收集各组约105个NB4细胞2份,179×g离心5 min,弃上清,用PBS洗涤两次,500 μl Binding缓冲液悬浮细胞。1份按Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书检测细胞凋亡情况;1份加入2.5 μl CD33-FITC和4.5 μl CD11b-PE,混匀,室温避光反应15 min,检测细胞分化情况。实验设2个复管,重复2次。

5. 实时荧光定量PCR检测PML-RARα融合基因不同剪接体相对表达量:

收集药物处理组和对照组培养不同时间的NB4细胞,按RNA Kit试剂盒提取总RNA,验证浓度和纯度后,取样品总RNA 1 µg,依据M-MuLV试剂盒说明进行逆转录反应。由于三种剪接体的特殊性及荧光定量PCR片段大小的限制(<150 bp),将相同亚细胞定位的E5(+)E6(+)及E5(-)E6(+)剪接体表达总量用E6(+)表示,并将探针与共同的下游引物设计在RARα的第3外显子区域,而通过分别位于PML第4、6外显子上的两个特异上游引物,将剪接体E6(+)和E5(-)E6(-)进行区分。引物探针序列参照文献[5]设计,均由上海基康生物技术有限公司合成。PCR体系:cDNA 2 μl,Premix Ex Taq 12.5 μl,DEPC水8.5 μl,上、下游引物(E5-6-F、E5-6-R、E6+F、E6+R)各0.5 μl(10 μmol/L),TaqMan探针1 μl(10 μmol/L),共25 μl。以ABL为内参。反应条件:预变性95 ℃ 10 s;变性95 ℃ 15 s,退火60 ℃ 30 s,共45个循环。为了更为直观比较各剪接体表达量变化,将E5(-)E6(-)剪接体相对表达量采用剪接体表达量/内参ABL表达量×104进行表示,E6(+)剪接体相对表达量采用剪接体表达量/内参ABL表达量×102进行表示。

6. 统计学处理:

应用SPSS 20.0软件进行数据分析。数据符合正态分布,采用均数±标准差描述,应用重复测量的方差分析比较多组数据间的差异。P<0.05为差异有统计学意义。

结果
1.ATO分化与凋亡最佳浓度的确定:

随着ATO作用时间的延长,各浓度组NB4细胞呈现不同的分化与凋亡趋势,0.2 µmol/L ATO处理组NB4细胞CD11b的表达上升最为显著(表1),而1.5 µmol/L ATO处理组NB4细胞细胞凋亡最明显(表2)。由此确定ATO作用于NB4细胞呈现分化与凋亡的最佳浓度分别为0.2 µmol/L和1.5 µmol/L。

表1

不同浓度三氧化二砷(ATO)作用于NB4细胞不同时间后CD11b的阳性率(%,±s

表1

不同浓度三氧化二砷(ATO)作用于NB4细胞不同时间后CD11b的阳性率(%,±s

组别ATO处理时间
0h24 h48 h72 h96 h
对照组0.15±0.070.10±0.000.10±0.000.20±0.140.10±0.00
ATO处理组     
 0.1 µmol/L0.45±0.071.00±0.420.45±0.490.85±0.210.75±0.64
 0.2 µmol/L0.50±0.144.75±0.357.90±1.279.25±0.3510.65±0.50
 1.0 µmol/L0.65±0.071.40±0.713.45±0.643.30±0.713.25±0.35
 1.5 µmol/L0.45±0.211.05±0.211.25±0.210.70±0.140.60±0.14
 2.0 µmol/L0.15±0.070.20±0.140.40±0.420.70±0.280.35±0.35

注:每组设2个复孔,实验重复2次

表2

不同浓度三氧化二砷(ATO)作用于NB4细胞不同时间后细胞凋亡率(%,±s

表2

不同浓度三氧化二砷(ATO)作用于NB4细胞不同时间后细胞凋亡率(%,±s

组别ATO处理时间
0h24 h48 h72 h96 h
对照组0.25±0.210.20±0.140.35±0.350.40±0.420.50±0.57
ATO处理组     
 0.1 µmol/L0.70±0.140.65±0.070.70±0.280.85±0.491.30±0.28
 0.2 µmol/L0.55±0.071.10±0.281.05±0.071.40±0.141.55±0.21
 1.0 µmol/L0.60±0.141.75±0.352.75±0.3518.40±2.2621.00±1.41
 1.5 µmol/L0.65±0.212.20±0.423.00±1.4118.25±2.4746.50±2.12
 2.0 µmol/L1.35±0.923.85±1.6313.35±2.330.30±0.140.25±0.07

注:每组设2个复孔,实验重复2次

2.E6(+)、E5(-)E6(-)剪接体表达量变化:

结果见表3,1.5 µmol/L ATO作用于NB4细胞,随着作用时间的延长E6(+)、E5(-)E6(-)剪接体的表达量均呈逐渐下降趋势,且各时间点与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)(表3);0.2 µmol/L ATO作用于NB4细胞,随着药物作用时间的延长E6(+)、E5(-)E6(-)剪接体表达量下降趋势不明显,且各时间点与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)(表4)。同一浓度、同一时间点E6(+)、E5(-)E6(-)剪接体表达量下降程度差异均无统计学意义(P>0.05)。这一结果提示,各剪接体对不同浓度ATO作用的敏感性差异无统计学意义。

表3

1.5 µmol/L三氧化二砷(ATO)处理NB4细胞凋亡过程中E6(+)、E5(-)E6(-)剪接体相对表达量的变化(±s

表3

1.5 µmol/L三氧化二砷(ATO)处理NB4细胞凋亡过程中E6(+)、E5(-)E6(-)剪接体相对表达量的变化(±s

组别E6(+)E5(-)E6(-)
处理0 h处理24 h处理48 h处理72 h处理96 h处理0 h处理24 h处理48 h处理72 h处理96 h
ATO处理组24.44±9.1110.35±8.584.66±1.310.27±0.27a0.32±0.35 a20.27±15.409.92±11.287.10±7.300.11±0.23a0.00±0.00a
对照组24.44±9.1129.97±18.0714.67±7.5513.17±11.175.39±0.5020.27±15.4020.58±20.5717.44±14.8922.89±29.394.06±1.34

注:a与对照组比较,P<0.05。每组设2个复孔,实验重复2次

表4

0.2 µmol/L三氧化二砷(ATO)处理NB4细胞分化过程中E6(+)、E5(-)E6(-)剪接体相对表达量的变化(±s

表4

0.2 µmol/L三氧化二砷(ATO)处理NB4细胞分化过程中E6(+)、E5(-)E6(-)剪接体相对表达量的变化(±s

组别E6(+)E5(-)E6(-)
处理0 h处理24 h处理48 h处理72 h处理96 h处理0 h处理24 h处理48 h处理72 h处理96 h
ATO处理组24.44±9.1113.01±0.7011.44±8.1714.75±14.063.80±1.1320.27±15.4015.67±17.6712.78±21.7013.51±24.450.55±0.42
对照组24.44±9.1129.97±18.0714.67±7.5513.17±11.175.39±0.5020.27±15.4020.58±20.5717.44±14.8922.89±29.394.06±1.34

注:每组设2个复孔,实验重复2次

讨论

目前研究表明,90%以上人类基因经历选择性剪接,与各类疾病均有一定的相关性[11],且不同基因剪接异构体对药物作用的敏感性可有不同[5]。如在成人急性淋巴细胞白血病(ALL)中,由于糖皮质激素受体(GR)存在选择性剪接,形成四种转录本GRα、GRβ、GRγ和GR-P,这些不同转录本在糖皮质激素(GC)抵抗及ALL进展过程中发挥不同的作用,GRα、GRγ高表达与GC抵抗相关而GR-P低表达与GC抵抗相关[12]。本课题组前期研究发现的PML-RARα融合基因三种剪接体E5(+)E6(+)、E5(-)E6(+)、E5(-)E6(-),由于不同的亚细胞定位而表现出对ATRA作用具有不同的敏感性[5]。因此,明确不同剪接体对不同药物作用的敏感性,对于指导临床用药及个体化治疗有重要的意义。

ATO在治疗APL中的作用表现突出,目前认为其抗白血病机制在于促进细胞凋亡、诱导细胞分化、抑制细胞增殖以及抑制骨髓微血管生成等。本研究结果显示,0.2 µmol/L ATO作用NB4细胞后CD11b的表达随作用时间增加呈逐渐上升的趋势,1.5 µmol/L ATO作用后细胞凋亡率随作用时间增加呈明显上升的趋势,与文献[8,13]报道一致。随后我们用荧光定量PCR法检测了剪接体E6(+)、E5(-)E6(-)表达水平,结果表明,最佳分化浓度0.2 µmol/L ATO作用NB4细胞不同时间,各剪接体表达量下降不明显;最佳凋亡浓度1.5 µmol/L ATO作用组E6(+)、E5(-)E6(-)剪接体的表达量呈明显的下降趋势,且同一浓度、同一时间点E6(+)、E5(-)E6(-)两种剪接体表达量下降程度无差异,提示各剪接体虽具有不同的亚细胞定位,但对于ATO表现出同样的敏感性,可能与此药物作用靶点位于各剪接体共有区域的PML基因有关。

综上,我们推测,在APL中L型PML-RARα融合基因三种剪接体对ATO作用敏感且无明显差异,其表达量下降可能主要是通过ATO促凋亡途径发挥作用而实现的,从而将胞质定位的对ATRA作用敏感性差的E5(-)E6(-)剪接体进行降解,故临床上表现出ATRA与ATO两药联合治疗后突出的疗效。下一步我们将构建单一剪接体的慢病毒表达体系,在单克隆细胞水平对各剪接体对ATO作用的敏感性进行进一步探讨。

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