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论著
脐血单个核细胞体外诱导分化为粒系细胞的研究
中华血液学杂志, 2017,38(06): 532-536. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-2727.2017.06.013
摘要
目的

探索脐血来源单个核细胞体外诱导分化为粒系细胞的方法。

方法

采用羟乙基淀粉沉降红细胞,淋巴细胞分离液分离单个核细胞。选择不同的培养基、添加剂以及培养模式诱导粒系细胞分化,显微镜观察细胞形态,流式细胞术检测细胞表型,免疫荧光测定粒系细胞CD18表达,并检测细胞吞噬功能。

结果

采用X-VIVOTM15中添加细胞因子TPO、SCF、G-CSF诱导粒系细胞,细胞存活率、细胞数、粒系细胞分化效率均优于添加胎牛血清组。与SCGM培养基诱导粒系细胞相比,X-VIVOTM15培养基效果更佳,且成本低。采用造血干细胞扩增和在基础培养基X-VIVOTM15中添加细胞因子TPO、SCF、G-CSF诱导粒系细胞的两阶段扩增、诱导模式,21 d细胞扩增倍数近132倍;流式细胞术检测表明,粒系细胞分化效率滞后于直接诱导模式,粒系标志CD15表达分别为(69.60±1.06)%和(97.73±0.39)%;瑞氏-吉姆萨染色可见成熟的分叶核粒细胞;免疫荧光方法检测显示溶酶体蛋白CD18的表达;成熟的粒细胞具有较强吞噬墨汁的功能,吞噬效率为(51.43±0.05)%。且在细胞趋化因子IL-8作用下,粒细胞具有趋化作用。

结论

优化了诱导粒系细胞培养体系和培养模式,获得了具有一定功能的粒系细胞。

引用本文: 陈琳, 谢小燕, 聂纪芹, 等.  脐血单个核细胞体外诱导分化为粒系细胞的研究 [J]. 中华血液学杂志,2017,38( 6 ): 532-536. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-2727.2017.06.013
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粒系细胞是血液非特异性免疫系统的重要组成部分,特别是中性粒细胞,在非特异性免疫应答中执行重要的生理功能。粒细胞缺乏常导致头晕、乏力,此外还可出现严重感染症状,感染部位以肺、尿路、皮肤等多见,易发生脓毒血症或败血症,病死率可达25%。中性粒细胞减少症是由于外周血中性粒细胞数量减少而产生的综合征,是肿瘤治疗中最常见的并发症,在接受化疗的实体肿瘤患者中发生率为10%~20%,院内的病死率达到9.8%。尽管重组G-CSF可通过促进人造血干细胞向粒系分化,从而发挥预防中性粒细胞减少症的作用,但其治疗效果并不明显。对于抗生素治疗无效而感染风险极高的粒细胞减少症,需通过移植粒细胞的方法进行治疗。CD34+造血干细胞诱导、分化为粒细胞的研究多有报道[1,2]。本研究我们探索脐血来源的单个核细胞体外诱导粒系细胞的最佳培养体系和培养模式,以期为临床应用治疗粒细胞减少症奠定实验基础。

材料与方法
一、一般资料

5份脐血来自足月健康新生儿,脐血的获取均得到产妇的知情同意。

二、仪器与试剂

6%羟乙基淀粉和人淋巴细胞分离液均购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司;X-VIVOTM15培养基购自瑞士Lonza公司;SCGM无血清培养基购自德国Cell Genix公司;生长因子hSCF、hFlt-3、hIL-6、hIL-3、hG-CSF、IL-8均购自美国PeproTech公司;胎牛血清(FBS)购于美国Gibco公司。TPO购自沈阳三生制药有限责任公司;抗人CD15-PE单克隆抗体、抗人CD35-APC单克隆抗体和抗人CD11b-Percp单克隆抗体购自美国eBioscience公司;小鼠抗人CD-18单克隆抗体购自英国Abcam公司;山羊抗小鼠IgG-FITC抗体购自中杉金桥ZSGB-BIO公司;瑞氏-吉姆萨A液和B液购自BaSo珠海贝索生物科技有限公司;得阁墨汁购自北京利明恒通工贸有限公司;0.9%生理盐水购自石家庄四药有限公司;Transwell小室及24孔板购于美国Corning公司;Vi-CELLXR细胞活力分析仪购自德国贝克曼公司;5910型低温离心机购自日本久保田公司;CKS31倒置显微镜购自日本OLYMPUS公司;TXD3细胞涂片离心机购自湘仪离心机公司;倒置荧光显微镜和正置显微镜购自日本Nikon公司;流式细胞仪购自美国BD公司。

三、粒系细胞获得
1. 粒系细胞诱导:

脐血采用6%羟乙基淀粉室温沉降红细胞15~30 min。小心吸取上清,生理盐水重悬细胞。缓慢加入含淋巴细胞分离液的管中,室温密度梯度离心20 min,收集中间白膜层,生理盐水洗涤2次,细胞计数。接种单个核细胞,置于37 ℃、5% CO2培养箱中进行诱导扩增、传代,诱导14~21 d后取细胞进行检测。

2. 粒系细胞培养条件选择:

采用含50 ng/ml SCF、50 ng/ml G-CSF的X-VIVOTM15无血清培养基,添加不同50 ng/ml TPO、10%FBS诱导脐血单个核细胞分化为粒系细胞,24孔板培养,检测细胞数、存活率及标志分子CD15、CD11b和CD35表达。

脐血单个核细胞采用不同的无血清培养基X-VIVOTM15和SCGM,并添加50 ng/ml TPO、50 ng/ml SCF、50 ng/ml G-CSF进行粒系细胞诱导扩增,24孔板培养,检测细胞数以及标志分子CD15、CD11b和CD35的表达。

3. 粒系细胞扩增诱导模式的选择:

采用含50 ng/ml SCF、10 ng/ml TPO、20 ng/ml IL-3、10 ng/ml IL-6、50 ng/ml Flt3的stemspan培养基扩增脐血单个核细胞,含50 ng/ml TPO、50 ng/ml SCF、50 ng/ml G-CSF的X-VIVOTM15培养基粒系诱导的两阶段培养、诱导模式,细胞接种密度为4×106/ml,于培养瓶中进行扩大培养。

四、粒系细胞形态学观察

取2×105/片细胞1 200 r/min离心3 min(离心机半径为7.5 cm)。瑞氏-吉姆萨染色,显微镜观察细胞形态。

五、免疫荧光检测粒系细胞CD18表达

取2×107个细胞于EP管中,PBS洗1次,4%多聚甲醛4 ℃固定1 h后,弃上清。加入300 μl含0.1%Triton的PBS中,4 ℃处理15~30 min,离心,弃上清。PBS洗涤,加1%BSA混匀,加入1∶300稀释的小鼠抗人CD18抗体,4 ℃孵育1 h。PBS洗涤,弃上清。PBS重悬细胞,加入1∶200稀释的FITC标记的抗小鼠二抗,4 ℃孵育1 h,PBS洗涤,离心,弃上清。PBS重悬细胞,1 000 r/min离心5 min甩片(离心半径7.5 cm),荧光显微镜下观察。

六、流式细胞术检测粒系细胞表面标志

每管取2×105个细胞,生理盐水洗2次,加入100 μl生理盐水重悬,以不同荧光标记IgG抗体为对照组,实验组为分别加入CD15-PE、CD35-APC、CD11b-Percp抗体以及三种抗体同时加入组,每个样品重复检测3次。4 ℃孵育30 min。生理盐水洗2次,加入200 μl重悬,筛网过滤,上机检测。

七、粒细胞吞噬功能检测

生理盐水按1∶1 000稀释墨汁,取1×106个细胞悬于100 μl生理盐水中,加入100 μl稀释好的墨汁,37 ℃孵育3 h,生理盐水洗2~3次,1 000 r/min离心5 min甩片(离心半径7.5 cm)。瑞士-吉姆萨染色,显微镜观察100个细胞中墨汁的吞噬情况。

八、粒系细胞趋化作用[3]

X-VIVOTM培养基稀释IL-8浓度分别为50、100 ng/ml,以X-VIVOTM培养基作为空白对照组,加入24孔板中,每孔1 000 µl。装入Transwell小室,并加入生理盐水稀释的细胞(1×106/ml),每孔100 µl,放置于37 ℃、5%CO2孵箱中60 min,0.2%结晶紫染色Transwell小室30 min,显微镜观察并拍照,计算粒细胞的趋化效率。

九、统计学处理

采用SPSS软件进行统计学处理,多组均数比较采用方差分析,两组间均数的比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

结果
一、血清对粒系细胞诱导扩增的影响

采用含SCF、G-CSF细胞因子的X-VIVOTM15培养基中,添加影响粒系细胞培养诱导成分FBS或TPO诱导14 d,观察对粒系细胞诱导扩增的影响。结果显示,加入FBS抑制粒系细胞扩增和表达(表1)。故选择含SCF、G-CSF、TPO的X-VIVOTM15培养基作为诱导扩增粒系细胞的培养基。

表1

血清对粒系细胞诱导扩增的影响(±s

表1

血清对粒系细胞诱导扩增的影响(±s

组别细胞数(×107)存活率(%)CD15+细胞(%)CD15+CD11b+细胞(%)
TPO+/FBS-2.58±0.03a95.11±0.13a94.05±0.40a52.60±3.54
TPO+/FBS+1.09±0.0489.28±0.2588.22±0.3844.13±4.40
TPO-/FBS+0.79±0.0286.60±0.3684.53±0.2147.85±4.88

注:TPO+/FBS-组与其他两组比较,aP<0.01。每组设3个复孔,实验重复4次

二、不同培养基培养诱导粒系细胞的效果

选择含TPO、SCF、G-CSF因子组合X-VIVOTM 15或SCGM培养基,诱导扩增粒系细胞14 d,结果显示,粒系细胞在X-VIVOTM15培养基中细胞数及CD15+表达高于SCGM;两种培养基诱导的晚幼粒及成熟粒系细胞表型CD15+CD11b+,CD35+ CD15+表达差异无统计学意义(P>0.05),因此,首选X-VIVOTM15作为粒系细胞基础培养基(表2)。用该培养体系继续诱导粒系细胞21 d,CD15+、CD15+CD11b+表达差异无统计学意义[分别为(91.68±0.32)%和(47.50±2.55)%],CD35+ CD15+表达[(78.65±1.63)%]与诱导14 d相比,明显增高。

表2

不同培养基培养诱导粒系细胞(±s

表2

不同培养基培养诱导粒系细胞(±s

组别细胞数(×107)CD15+细胞(%)CD15+CD11b+细胞(%)CD35+CD15+细胞(%)
X-VIVOTM15培养组1.46±0.0397.73±0.3953.15±2.3349.35±1.06
SCGM培养组0.86±0.0184.35±1.9151.35±4.7449.90±8.06
t值0.8733.4680.024-0.008
P值<0.001<0.0010.6770.932

注:每组设3个复孔,实验重复4次

瑞氏-吉姆萨染色,细胞形态观察可见在粒系细胞诱导分化过程中出现大量的分叶核粒细胞,同时有少量早幼粒细胞及更原始的祖细胞(图1)。

图1
X-VIVOTM15培养基体外诱导的粒系细胞形态(瑞氏-吉姆萨染色,×400)
图1
X-VIVOTM15培养基体外诱导的粒系细胞形态(瑞氏-吉姆萨染色,×400)
三、分阶段扩增诱导粒系细胞

采用先扩增造血干细胞7 d,再进行粒系细胞诱导14 d的两阶段培养法,扩增倍数为132倍,粒系细胞表面标志CD15+表达水平为(69.6±1.06)%,CD15+CD11b+为(34.11±1.27)%,CD15+CD35+为(26.83±1.17)%。粒系细胞分化效率滞后于直接诱导模式。

1. 诱导的粒系细胞形态:

在倒置显微镜下观察体外诱导的粒系细胞,多数细胞为圆形、体积小,在生长因子的刺激下可诱导分化为粒系细胞,仅存在少量、体积大的巨噬系细胞(图2A)。瑞氏-吉姆萨染色可见不同阶段的粒细胞。成熟的分叶核粒细胞胞核更致密,呈带状钝弯或分叶状,核质比更小,胞质嗜碱性消失,着色淡红(图2B)。

图2
体外诱导粒系细胞显微镜下形态

A:倒置显微镜下观察诱导的粒系细胞;B:普通显微镜下观察诱导的粒系细胞(瑞氏-吉姆萨染色,×1 000)

图2
体外诱导粒系细胞显微镜下形态
2. 诱导的粒系细胞CD18检测:

CD18是粒细胞中的溶酶体蛋白,免疫荧光检测显示,脐血单个核细胞经体外诱导获得的粒系细胞CD18抗体检测为阳性,发绿色荧光(图3)。

图3
荧光显微镜下观察示体外诱导的粒系细胞CD18表达阳性
图3
荧光显微镜下观察示体外诱导的粒系细胞CD18表达阳性
3. 诱导的粒系细胞吞噬功能:

墨汁吞噬实验表明,体外扩增诱导的粒系细胞具有一定的吞噬墨汁的功能,吞噬效率为(51.43±0.05)%(图4)。

图4
体外诱导的粒系细胞吞噬功能(瑞氏-吉姆萨染色,×1 000)
图4
体外诱导的粒系细胞吞噬功能(瑞氏-吉姆萨染色,×1 000)
4. 诱导的粒系细胞趋化作用:

粒细胞趋化作用研究显示,0、50、100 ng/ml IL-8作用下,粒细胞趋化效率分别为(37.50±3.69)%、(71.58±5.96)%、(97.28±1.32)%,随着细胞趋化因子IL-8浓度增加,粒细胞趋化效率增强。

讨论

近十年来,随着造血干细胞研究的进一步深入,造血干/祖细胞在体外诱导分化为血液细胞的临床应用越来越受到人们重视[4,5,6]。临床上,粒细胞移植治疗存在血型、HLA配型、移植剂量、移植后治疗效果和细胞数量等问题[7,8]。而造血干细胞移植,中性粒细胞重建存在滞后现象,体外诱导造血干细胞制备的粒细胞则为粒细胞移植治疗提供了新的希望。Haylock等[9]通过添加均为10 ng/ml的IL-1、IL-3、IL-6、G-CSF、GM-CSF、SCF诱导CD34+造血干祖细胞体外制备CFU-GM。有文献报道,采用添加SCF、FL、IL-3和TPO的X-VIVO 15专用培养基扩增正常人的造血干/祖细胞,获得的细胞产品命名为CLT-008,用于治疗化疗患者粒细胞减少症的临床实验[10],为保证获得足量的造血干/祖细胞,需要多名供血者以满足需求。由于脐血对配型要求低,但存在细胞植入时间偏长的问题,可以通过体外诱导扩增满足移植的需要。Nielsen研究团队采用stemlineTMⅡ培养基,通过WAVE生物反应器实现大规模诱导扩增脐血来源的CD34+造血干祖细胞为中性粒细胞,并且命名为eNeut。来源于脐血的细胞,免疫原性低,可以直接用于异体移植,或采用25 Gy照射诱导的粒细胞,以避免移植物抗宿主病(GVHD),照射的细胞其体内功能不会受到影响[11,12,13]

由于脐血易于获得,其造血干细胞与骨髓相当,高于外周血,而造血干细胞来源于单个核细胞[14]。本研究则采用脐血来源的单个核细胞作为种子细胞,探索不同培养诱导配方、模式对粒系诱导扩增的影响。结果表明,采用X-VIVOTM15中添加TPO、SCF、G-CSF进行脐血单个核细胞诱导粒系细胞,细胞存活率、细胞数、粒系细胞分化效率均优于添加胎牛血清组。与SCGM培养基诱导粒系细胞相比,X-VIVOTM15培养基效果更佳,成本更低。且随着诱导时间延长,成熟粒细胞分化效率增加。为了获得更多的粒细胞,采用造血干细胞扩增和在基础培养基X-VIVOTM15中添加TPO、SCF、G-CSF诱导粒系细胞的两阶段扩增、诱导模式,培养21 d细胞扩增倍数为132倍,28 d扩增倍数为2 590.5倍。以1份脐血获得108单个核细胞计算,体外诱导28 d可获得1011细胞,能够满足移植需求。有研究显示,当粒细胞移植量在(2~10)×1010时,移植后体内中性粒细胞水平在24 h内可维持于正常水平。流式细胞术检测粒系细胞表面标志表明,采用两阶段模式,粒系细胞分化效率滞后于直接诱导[CD15+表达分别为(69.6±1.06)%和(97.73±0.39)%,CD15+CD11b+表达分别为(34.11±1.27)%和(53.15±2.33)%,CD15+CD35+表达分别为(26.83±1.17)%和(49.35±1.06)],可通过延长诱导时间以增加粒系细胞分化效率和数量;瑞氏-吉姆萨染色观察可见,经体外培养产生成熟的具有分叶核的粒系细胞,此外仍可见早期的粒细胞,与文献[15]报道一致;免疫荧光检测,粒系细胞胞内表达溶酶体蛋白CD18分子;成熟的粒细胞具有吞噬墨汁的功能,吞噬效率为(51.43±0.05)%。粒细胞对细胞趋化因子IL-8具有趋化作用,且随着IL-8浓度增加趋化效率增强,IL-8浓度为100 ng/ml时,粒细胞趋化效率为97.28%。该研究表明,脐血单个核细胞经体外扩增、诱导可获得大量的、具有吞噬功能和趋化作用的粒系细胞,为临床应用提供实验基础。

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关键词
主题词
胎血
单个核细胞
粒系细胞